當(dāng)歸補血湯水提液預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞線粒體損傷保護(hù)機制研究

周春剛， 李 卿， 湯 加， 徐 辰， 張志斌（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室，江蘇無錫214062）

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當(dāng)歸補血湯水提液預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞線粒體損傷保護(hù)機制研究

周春剛， 李 卿， 湯 加， 徐 辰， 張志斌*
（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室，江蘇無錫214062）

摘要：目的 探討當(dāng)歸補血湯預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞線粒體損傷保護(hù)機制。方法 復(fù)制缺氧/復(fù)氧大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，以始終在正常培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞為正常對照組，將預(yù)先加入當(dāng)歸補血湯的細(xì)胞（當(dāng)歸補血湯組）在正常條件下培養(yǎng)24 h，與未處理細(xì)胞（模型組）同時進(jìn)行缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)，JC-1染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位，DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（IOS）水平，IT-PCI熒光相對定量檢測B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl2）、Bc12相關(guān)X蛋白（Baχ）、bc1-2/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3（Bnip3）的m INA表達(dá)水平，Western b1ot檢測細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)IOS水平增加明顯（P＜0.05），細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bcl2 m INA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Baχm INA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)歸補血湯干預(yù)后，與模型組比較，線粒體膜電位下降的細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl2 m INA水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后，線粒體膜電位明顯下降，細(xì)胞色素C釋放增加。當(dāng)歸補血湯可能通過促進(jìn)Bcl2表達(dá)，減少IOS產(chǎn)生等機制穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，減輕復(fù)氧后對線粒體功能的損傷作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸補血湯；H9c2心肌細(xì)胞；線粒體損傷；Bc12；活性氧

目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的機制主要有大量IOS產(chǎn)生、鈣離子超載、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡為主的心肌不可逆損傷等［1］。細(xì)胞能量代謝障礙與心肌缺血再灌注損傷機制的多個環(huán)節(jié)密切相關(guān)。線粒體作為氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的重要細(xì)胞器，線粒體功能障礙，線粒體凋亡等病理過程造成對心肌細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害［2］。目前以線粒體為靶點治療心肌缺血再灌注損傷的藥理作用機制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補血湯能夠穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)凋亡基因蛋白P53表達(dá)，有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［3］。對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷，當(dāng)歸補血湯能減輕細(xì)胞水腫和纖維化，保護(hù)心肌細(xì)胞，阻礙心肌重構(gòu)［4］。而對其他器官組織如腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷及移植的內(nèi)耳干細(xì)胞等，當(dāng)歸補血湯能夠減輕細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)［5-7］。可見當(dāng)歸補血湯在不同病理條件下對組織損傷的保護(hù)作用表現(xiàn)其多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點。本實驗通過建立H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察當(dāng)歸補血湯對缺氧/復(fù)氧模型細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞（H9c2），購自上海拜力生物科技有限公司（ATCC CIL1446）。

1.1.2 當(dāng)歸補血湯煎劑制備 當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅，批號101027）；黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙，批號101109）。當(dāng)歸補血湯（5∶1）煎劑制備采用水提醇沉法［8］，選取黃芪20.83 g、當(dāng)歸4.17 g，加5～7倍雙蒸水，煎3次，合并濾液，濃縮至較小體積，加入95%乙醇至含醇量為60%～80%，冷藏，靜置24 h后，過濾，取濾液回收乙醇，藥液濃縮備用（藥液生藥含有量為1 g/mL）。實驗時將上述精制中藥加生理鹽水溶解，以氫氧化鈉、稀鹽酸調(diào)pH至7.2～7.4，采用DMEM高糖培養(yǎng)基定容后生藥量為50 mg/m L（原液），0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 DMEM高糖（美國Gibco公司，11995065）；胎牛血清（美國Gibco公司，6010159）；3S柱式細(xì)胞總INA抽提試劑盒（上海博彩生物科技有限公司，K362）；JC-1染色檢測線粒體膜電位試劑盒（美國BD公司，551302）；DCFH-DA熒光探針檢測IOS試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，S0033）；SYBI PrimeScript IT-PCI KitⅡ試劑盒（日本Takara公司，I I820A）；BCA蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010）；GAPDH單克隆抗體（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，Mab5465）；細(xì)胞色素C多克隆抗體（Bioss公司，bs-0013I）；羊抗兔二抗（美國Biowor1de公司，BS13278）。

1.1.4 儀器 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；LightCyc1er480熒光定量PCI儀（德國Ioche公司）；二氧化碳三氣培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，Thermo 3131）；二氧化碳普通培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，Thermo 371）；SmartSpec P1us分光光度計（美國Bio-Iad公司）。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型的建立H9C2細(xì)胞株生長在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期H9c2細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶接種2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞上清液，更換DMEM無糖無血清培養(yǎng)基，然后置入37℃、含94% N2﹑5% CO2﹑1% O2三氣培養(yǎng)箱中3 h，即為缺氧。棄去上清液，更換含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，置入37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，即為復(fù)氧。實驗設(shè)正常對照組（細(xì)胞始終在正常培養(yǎng)條件下，37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、模型組（正常培養(yǎng)條件下37℃、含5%CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后缺氧/復(fù)氧條件下培養(yǎng)）、當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組（正常培養(yǎng)條件預(yù)先加入當(dāng)歸補血湯500 μg/mL，37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，與模型組同時進(jìn)行缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)）。

1.2.2 JC-1染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位 當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組和模型組細(xì)胞復(fù)氧30 min后，與正常對照組同時檢測線粒體膜電位。檢測前，配制新JC-1工作液（1∶100），樣本平均細(xì)胞數(shù)2×105個，每個樣本加入0.5 mL JC-1工作液，37℃CO2培養(yǎng)箱孵育15 min，洗滌細(xì)胞2次，每個樣本加入0.5 m L 1×緩沖液上機檢測。

1.2.3 DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)IOS水平 細(xì)胞收集后懸浮于熒光探針DCFH-DA（無血清DMEM 1∶1 000稀釋）中，終濃度為10 μmo1/L。細(xì)胞密度為1× 106個/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，用無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。Iosup（50 mg/mL）作為活性氧陽性對照。

1.2.4 H9c2細(xì)胞總INA提取 采用3S柱式細(xì)胞總INA抽提試劑盒，按照試劑盒上操作步驟完成總INA的提取。在吸光度260 nm處測定INA水平，樣本INA在10～30 ng/μL，260/280 nm吸光度（D）比值范圍在1.2～1.9之間。INA提取物-80℃保存。

1.2.5 IT-PCI實時熒光相對定量 采用兩步法，管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，目的基因Bnip3、Baχ和Bcl2及內(nèi)參基因引物序列見表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。采用溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物的特異性。相對定量分析采用△△CT法，標(biāo)準(zhǔn)化比值計算公式采用2-△△CT［9］。

1.2.6 Western b1ot檢測H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白水平 細(xì)胞蛋白定量采用碧云天BCA蛋白定量試劑盒，取細(xì)胞蛋白提取液上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5% BSA封閉1.5 h后分別加入將膜放入雜交袋中加入一抗（1∶300稀釋），封口，室溫下孵育1 h，4℃過夜。4℃過夜孵育，用1×TBST洗膜后，以相應(yīng)的二抗孵育15 h，并以GAPDH（1∶500稀釋）單克隆抗體作為內(nèi)參對照。采用Image-Pro P1us 4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以靶蛋白/GAPDH吸光度比值反映靶蛋白水平。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征

1.2.7 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5軟件，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異顯著性分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧損傷后流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞線粒體膜電位 正常培養(yǎng)條件下的對照組心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（11.28±3.87）%，模型組細(xì)胞在復(fù)氧30 min后，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（28.89± 5.34）%，兩組比較，線粒體膜電位水平具有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)歸補血湯干預(yù)后結(jié)果顯示，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（15.85±2.76）%，與模型組比較，能夠顯著降低復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞早期凋亡率（P＜0.05），見表2。

表2 H9c2細(xì)胞線粒體膜電位（±s，n＝6）

表2 H9c2細(xì)胞線粒體膜電位（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別　　線粒體膜電位降低的細(xì)胞比例/%正常對照組11.28±3.87模型組　28.89±5.34*當(dāng)歸補血湯組　15.85±2.76▲

2.2 DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞內(nèi)IOS水平 模型組在復(fù)氧30 min后細(xì)胞內(nèi)IOS水平為（31.12±7.07）%，與正常組比較，IOS水平顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)歸補血湯干預(yù)組IOS水平為（7.36± 2.62）%，與模型組比較，IOS水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 細(xì)胞內(nèi)R0 S水平（±s，n＝6）

表3 細(xì)胞內(nèi)R0 S水平（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別　IOS水平/%正常對照組0.64±0.13模型組　31.12±7.07*當(dāng)歸補血湯組　7.36±2.62▲陽性對照組53.95±6.12

2.3 IT-PCI法檢測的Bcl2、Baχ、Bnip3 m INA表達(dá)水平

與正常對照組比較，模型組Bcl2 m INA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Baχm INA水平顯著升高（P＜0.05），Bnip3 m INA水平亦升高，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。當(dāng)歸補血湯干預(yù)后，與模型組比較，Bcl2 m INA表達(dá)水平顯著升高，Baχ、Bnip3 m INA水平表達(dá)水平均有降低，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 Bcl2、Baχ、Bnip3的mRNA表達(dá)水平（±s，n＝6）

表4 Bcl2、Baχ、Bnip3的mRNA表達(dá)水平（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

Bcl2　Baχ　Bnip3正常對照組組別1.36±0.42　 0.64±0.12　 0.66±0.24模型組　0.49±0.15*1.48±0.41*　1.19±0.41當(dāng)歸補血湯組　1.04±0.14▲1.12±0.12　 0.88±0.16

2.4 H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平 與正常對照組比較，模型組細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有顯著意義（P＜0.05）；當(dāng)歸補血湯干預(yù)后細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平（±s，n＝6）

3 討論

線粒體的結(jié)構(gòu)、功能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。正常線粒體膜電位的形成是保持線粒體功能所必需的。線粒體膜電位下降為凋亡的特征性改變。一旦線粒體膜電位損耗，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程［10］。實驗結(jié)果表明，心肌細(xì)胞復(fù)氧30 min后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯減低，細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞色素C氧化是內(nèi)源性IOS主要來源，細(xì)胞內(nèi)IOS水平顯著升高，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，功能受損。經(jīng)過當(dāng)歸補血湯預(yù)處理心肌細(xì)胞，細(xì)胞早期凋亡率和IOS水平均明顯降低，表明當(dāng)歸補血湯能夠提高細(xì)胞耐受氧化應(yīng)激，抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。關(guān)欣等認(rèn)為當(dāng)歸黃芪超濾膜提取物預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷以及氧化損傷的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用［11］。孫艷等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補血湯能夠通過穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，通過線粒體凋亡途徑，有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［3］。

在分子水平對缺氧/復(fù)氧損傷后Bcl2、Baχ、Bnip3 m INA表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷后Baχm INA表達(dá)顯著升高，Bcl2 m INA則明顯降低，而Bnip3 m INA水平亦降低，表明缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡通過線粒體凋亡途徑。當(dāng)歸補血湯預(yù)處理心肌細(xì)胞Bcl2 m INA表達(dá)升高，細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)減低。細(xì)胞色素C及其它凋亡分子的釋放受Bc12家族蛋白的調(diào)控［12］。BNIP3屬于BH3-on1y亞族，其通過BH3結(jié)構(gòu)可以與Bc12抗凋亡蛋白結(jié)合，抑制Bc12的抗凋亡作用，Bax和Bak可能與BNIP3聯(lián)合作用于線粒體，誘導(dǎo)IOS產(chǎn)生、膜電位消失和線粒體細(xì)胞色素C釋放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。當(dāng)歸補血湯通過線粒體凋亡途徑，上調(diào)Bcl2 m INA表達(dá)，抑制細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)，提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力，進(jìn)一步證明當(dāng)歸補血湯對線粒體功能損傷具有保護(hù)作用。

目前，已對缺血再灌注的分子機制進(jìn)行了廣泛研究，其中以線粒體凋亡信號通路中的蛋白作為治療靶點篩選各種抑制劑已取得了一定的進(jìn)展，如勞丹烷型二萜能夠通過誘導(dǎo)蛋白激酶B（Akt）磷酸化和增加Bc12的表達(dá)［14］，異氟烷通過促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)，NO合成增加，促進(jìn)線粒體ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）開放，抑制缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡［15］。然而單純一種藥物其作用靶點單一，很難取得較好的治療效果，臨床用藥受到限制。對當(dāng)歸補血湯主要組分黃芪及其黃芪主要成分黃芪多糖和黃芪皂苷的研究結(jié)果證實，黃芪可提高心肌細(xì)胞SOD的活性，清除自由基，并抑制脂質(zhì)過氧化作用，促進(jìn)糖原合成，抑制糖酵解并且糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒［16］，改善心肌細(xì)胞再灌注損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，激活線粒體ATP敏感鉀通道，減輕鈣超載等機制減輕缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷［17］。以上研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補血湯能夠作用多個靶點，在多個環(huán)節(jié)發(fā)揮抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。

傳統(tǒng)中藥復(fù)方藥效的發(fā)揮是各個化學(xué)組分獨立或相互綜合作用的結(jié)果，不僅對缺血/再灌注有良好的抑制作用，中藥兼有增強心功能和調(diào)節(jié)免疫等多方面的作用。但目前已知的對缺血/再灌注具有良好藥效的中藥單體及中藥復(fù)方尚少。尚需對當(dāng)歸補血湯在分子、細(xì)胞、動物模型不同方面對藥效進(jìn)行多水平、多方位、多靶點的系統(tǒng)性評價，對缺血再灌注損傷保護(hù)作用的分子機制進(jìn)行更深入、廣泛而細(xì)致的研究，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)。

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*通信作者：張志斌（1966—），女，主任技師，從事心管病方面研究。Te1：（0510）88859999-24509，E-mai1：491073429@qq.com

作者簡介：周春剛（1974—），男，碩士，副主任技師，從事心血管病方面研究。Te1：（0510）88859999-24509

基金項目：江蘇省無錫市科技局科技支撐發(fā)展項目（CSE01N1224）

收稿日期：2014-12-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.038

中圖分類號：I 285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）03-0658-04