HPLC法同時測定大鼠體內(nèi)5種大黃蒽醌類化合物

張 琳， 張寶琦， 王志軒， 劉一鑫， 常金花*， 劉翠哲*（.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德067000；.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

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HPLC法同時測定大鼠體內(nèi)5種大黃蒽醌類化合物

張 琳1， 張寶琦2， 王志軒1， 劉一鑫1， 常金花1*， 劉翠哲1*
（1.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

摘要：目的 建立同時測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚在大鼠血漿、尿液、糞便中含有量的HPLC法。方法 分析采用Agi1ent Ec1ipse P1us-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相分別為甲醇-1%甲酸水（78∶22）；體積流量1.0 mL/min，檢測血漿與尿液，以及甲醇-1%甲酸水（75∶25），體積流量0.8 mL/min，檢測糞便；檢測波長為254 nm；柱溫為30℃。結(jié)果 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率（n＝6）達到70%以上，ISD值均在12.6%以下。結(jié)論 該方法可用于體內(nèi)大黃蒽醌類成分的測定。

關(guān)鍵詞：蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；血漿；尿液；糞便；大鼠；HPLC

KEY W 0RDS：a1oe-emodin；rhein；emodin；chrysophano1；physcion；p1asma；urine；stoo1；rats；HPLC

大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Ba1f.或藥用大黃Rheum officinale Bai11.的干燥根和根莖［1］，是常用中藥之一［2-3］，其中蒽醌類成分為其有效物質(zhì)。本實驗擬建立同時測定大鼠灌胃大黃藥材提取物后血漿、尿液、糞便

中大黃游離蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚）含有量的HPLC法，以期為后期研究該類成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特性提供新的方法學基礎(chǔ)［4］，并為進一步闡明口服結(jié)腸定位給藥技術(shù)致大黃蒽醌發(fā)揮瀉下作用時增效減毒的機制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agi1ent 1260 Infinity高效液相色譜儀，包括DAD檢測器（美國安捷倫公司）；MS3DS25渦旋儀（德國IKA公司）；KQ2200DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC-12A氮氣吹干儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；GT-20B高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；GT-20B冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；DWFW110超低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫科技有限公司）；JA2003電子分析天平（上海精科天平廠）；SHZ-ⅢA型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；移液槍（上海漢林實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥 蘆薈大黃素（批號110795-201007，純度97.8%）、大黃酸（批號110757-200206，純度99.4%）、大黃素（批號110756-200110，純度98.8%）、大黃酚（批號110796-201118，純度99.6%）、大黃素甲醚（批號110758-201013，純度99.1%）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院，供含有量測定用。大黃藥材購自安國市邦康中藥材有限公司，經(jīng)趙春穎老師鑒定為藥用大黃，并存放于承德醫(yī)學院中藥研究所。甲醇、甲酸為色譜純；乙醚、乙酸乙酯為分析純。

1.3 動物 健康雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量250～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為2012-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 血漿與尿液 Agi1ent Ec1ipse P1us-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-1%甲酸水（78∶22）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30.0℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

2.1.2 糞便 Agi1ent Ec1ipse P1us-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-1%甲酸水（75∶25）；體積流量0.8 mL/min；柱溫30.0℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

2.2 5種游離蒽醌的混合對照品溶液的配制 分別精密稱取蘆薈大黃素3.98 mg、大黃酸3.80 mg、大黃素4.10 mg、大黃酚3.77 mg，置于50.0 mL量瓶中；以及大黃素甲醚4.39 mg，置于100.0 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，定容至刻度，即得儲備液。精密量取蘆薈大黃素儲備液5 mL、大黃酸10 mL、大黃素3 mL、大黃酚4 mL、大黃素甲醚2 mL，置于25.0 mL量瓶中，定容，即得質(zhì)量濃度分別為15.92、30.40、9.84、12.06、3.51 μg/mL 的5種混合對照品溶液。

然后，精密稱取1，8-二羥基蒽醌10.6 mg，置于100.0 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，定容，即得內(nèi)標儲備液。

2.3 生物樣品的制備

2.3.1 含5種大黃游離蒽醌血樣的制備 取健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，眼靜脈叢取血（取血前禁食過夜，不禁水），置于肝素管中，4℃下冷凍離心（3 000 r/min）10 min，分離血漿。取空白血樣100 μL，置于離心管中，加50 μL乙酸鹽緩沖液（pH＝5.0），渦旋混合30 s，再加入0.1 mo1/L鹽酸50 μL，渦旋混合30 s，分別用1 mL乙醚、1 mL混合溶劑（乙酸乙酯∶乙醚＝8∶2）、1 mL乙酸乙酯萃取3次，每次渦旋混合3 min，水層和有機層離心（3 000 r/min）3 min，將有機層轉(zhuǎn)移至另一試管中，35℃下N2揮干。殘余物用100 μL甲醇復溶，渦旋混合60 s，離心（12 000 r/min）5 min，取上清液，備用。

然后，取大鼠空白血樣100 μL，加入100 μL不同質(zhì)量濃度的對照品溶液和20 μL內(nèi)標溶液，同法處理，即得血漿質(zhì)控樣品。

2.3.2 含5種大黃游離蒽醌尿樣的制備 取空白尿樣1 mL，0.1 mo1/L HC1調(diào)節(jié)pH至4～5，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋3 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液。殘渣用2 mL乙酸乙酯再萃取一次，離心，取上清液，合并兩次上清液，35℃下N2揮干。殘渣用100 μL甲醇復溶，15 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

然后，精密量取不同質(zhì)量濃度的大黃總游離蒽醌混合對照品溶液和20 μL內(nèi)標溶液，35℃水浴下N2揮干甲醇。加入空白尿樣1 mL（0.1 mo1/L HC1調(diào)節(jié)pH至4～5），同法處理，即得尿樣質(zhì)控樣品。

2.3.3 含5種大黃游離蒽醌糞樣的制備 將大鼠糞便于40℃烘箱中烘干，用研缽搗碎成粉末，取空白糞便粉末0.1 g，依次加入pH＝4.0的酸水0.5 mL、0.1 mo1/L HC10.5 mL、混合溶劑（乙酸乙酯∶乙醚＝10∶1）2 mL，渦旋3 min，3 000 r/min離心5 min，收集上清液。重復操作兩次，合并上清液，35℃下N2揮干，甲醇溶解定容至100 μL，15 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。

然后，精密量取大黃游離蒽醌混合對照品溶液和20 μL內(nèi)標溶液，35℃水浴N2揮干甲醇，加入0.1 g空白糞便，同法處理，即得糞便質(zhì)控樣品。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的繪制和線性范圍 取空白血樣、尿樣與糞樣，分別加入不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，制得系列生物樣品，按“2.3”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 5種成分的標準曲線和線性范圍（n＝6）Tab.1 Standard curves and linear ranges of five consituents（n＝6）

2.4.2 專屬性試驗 分別將大鼠空白血樣、尿樣與糞樣的色譜圖與空白質(zhì)控樣品、大鼠灌胃給藥后血樣、尿樣與糞樣的HPLC色譜圖進行比較，考察生物樣品中的雜質(zhì)峰是否對樣品有干擾，結(jié)果見圖1～3。由圖可知，蒽醌類成分與其他成分達到基線分離，5種游離蒽醌成分的峰形理想，說明該方法專屬性良好。

2.4.3 精密度試驗 將低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液分別加到空白血樣、尿樣與糞樣中，按“2.3”項下方法處理，連續(xù)進樣6次，考察日內(nèi)精密度。分別記錄蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計算ISD值。結(jié)果，空白血樣中這5種成分峰面積的ISD值分別為0.4%、0.9%、0.5%、0.8%、1.0%；空白尿樣中分別為1.1%、1.0%、2.1%、2.0%、2.7%；空白糞樣中分別為1.1%、1.0%、2.1%、2.0%、2.7%。

按上述方法配制樣品溶液，每天測定1次，連續(xù)5天，計算日間精密度。分別記錄5種成分和內(nèi)標的峰面積，計算ISD值。結(jié)果，空白血樣中這5種成分峰面積的ISD值分別為3.1%、2.9%、3.3%、2.6%、3.5%；空白尿樣中分別為0.7%、 0.5%、1.5%、1.7%、2.3%；空白糞樣中分別為1.1%、1.3%、1.7%、1.6%、3.5%，表明儀器精密度良好。

圖1 血漿的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of p lasma

2.4.4 回收率試驗 分別配制含低、中、高質(zhì)量濃度的5種游離蒽醌成分的系列樣品，每種濃度處理6個樣品，記錄峰面積，計算回收率及ISD值。結(jié)果，質(zhì)控樣品中5種成分的回收率均達到70%以上，符合實驗要求，具體見表2。

圖2 尿樣的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of urine

圖3 糞便的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of stool

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 將低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液分別加到空白血樣、尿樣與糞樣中，按“2.3”項下方法處理，制得混合對照品溶液3份（每份均含3種濃度）。其中，一份在室溫下放置12 h后進樣，考察其穩(wěn)定性；一份于-20℃存放2周；一份反復凍融3次，考察-20℃冷凍及反復凍融對5種大黃蒽醌類化合物穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表3。由表可知，樣品在以上存儲和操作條件下均比較穩(wěn)定。

表2 5種成分的回收率（n＝6）Tab.2 Recoveries of five constituents（n＝6）

表3 5種成分的穩(wěn)定性（n＝6）Tab.3 Stabilities of five consitutents（n＝6）

3 討論

由于大鼠血漿中的內(nèi)源性成分以及尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物會影響目標化合物在HPLC中的分析檢測，故本實驗首先考察了不同的樣品處理方法，發(fā)現(xiàn)液液萃取最好。然后，考察了二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯［5-7］的萃取效果，通過比較峰形、分離度、回收率等發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取尿樣的效果最好，而乙醚和乙酸乙酯混合萃取血樣、糞樣的效果最好，雜質(zhì)較少，而且方法回收率較高。

在預實驗時，直接將空白糞樣加到對照品的甲醇溶液里，發(fā)現(xiàn)前端雜質(zhì)峰很高，表明樣品處理不干凈。若先用N2將對照品溶液中的甲醇吹干后，再加入空白糞樣，則雜質(zhì)峰得到改善。另外，處理糞樣時必須加入酸水，這樣可以降低其堿性，減少雜質(zhì)對測定成分的干擾。

大多數(shù)文獻使用40～50℃［8-9］的揮干溫度。實驗發(fā)現(xiàn)，若只萃取1次時，5種成分的回收率均偏低，故血樣萃取3次，尿樣與糞樣萃取2次，但溶劑量增大，溶劑揮干時間增多。若使用40～50℃的揮干溫度，5種蒽醌類成分的回收率仍然偏低。最終確定，在35℃下N2揮干時，5種成分的回收率均可達到70%以上。

在選擇流動相時，文獻大多用的是甲醇和磷酸［10-13］，但由于磷酸會損壞柱子，故改用甲酸［14-15］。通過考察不同流動相比例和含有量的甲酸時發(fā)現(xiàn)，提高水相比例后，保留時間變長，但可以降低糞便中雜質(zhì)峰對待測峰的干擾。最終確定，測定血漿與尿液時的流動相比例為甲醇-1%甲酸水（78∶22），而測定糞便中時為甲醇-1%甲酸水（75∶25），此時分離度較好，峰形較對稱。

若以血漿與尿液的色譜條件測定糞便樣品，當體積流量為1.0 mL/min時，糞便樣品中的雜質(zhì)峰將干擾待測成分，分離度不能滿足實驗要求；將其調(diào)整為0.8 mL/min后，將不再干擾檢測，分離度達到1.5以上。

綜上所述，本實驗采用的HPLC-DAD法分離度好，靈敏度高，可以同時提供5種蒽醌類成分的全波長掃描紫外譜圖，這為中藥大黃的多組分藥動學研究奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)考察，各項指標不僅達到生物樣品中藥物定量分析研究的方法學要求，而且回收率較高，重現(xiàn)性良好，是一種比較專一、靈敏、簡便的測定方法。

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Simultaneous determ ination of five rhubarb anthraquinones in rats by HPLC

ZHANG Lin1， ZHANG Bao-qi2， WANG Zhi-xuan1， LIU Yi-xin1， CHANG Jin-hua1*，LIU Cui-zhe1*

（I.Hebei Provincial Key Laboratory of Research and Development for Chinese Medicine；Institute of Chinese Materia Medica，Chengde Medical College，ChengdeO67OOO，China；2.Hospital Affiliated to ChengdeMedical College，ChengdeO67OOO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for the simu1taneous determination of contents of a1oe-emodin，rhein，emodin，chrysophano1and physcion in p1asma，urine and stoo1of rats.METH0DS The ana1ysiswas carried out on an Agi1ent Ec1ipse P1us-C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobi1e phases were methano1-1% formic acid aqueous（78∶22）at a f1ow rate of1 mL/min for p1asma and urine，and methano1-1% formic acid aqueous（75∶25）at a f1ow rate of 0.8 mL/min for stoo1，respective1y.The detection wave1ength was set at 254 nm.The co1umn temperature wasmaintained at 30℃.RESULTS A1oe-emodin，rhein，emodin，chrysophano1 and physcion showed good 1inear re1ationships，whose average recoveries（n＝6）were a11more than 70% with the ISDs of 1ess than 12.6%.C0 NCLUSI0N Thismethod can be used for the determination of rhubarb anthraquinones in vivo.

*通信作者：常金花（1981—），女，碩士，講師，研究方向為中藥制劑現(xiàn)代化。Te1：（0314）2290629，E-mai1：xiaoniqiu@126.com劉翠哲（1964—），女，博士，研究員，博士生導師，研究方向為中藥制劑現(xiàn)代化。Te1：（0314）2290359，E-mai1：1iucuizhexy@163.com

作者簡介：張 琳（1989—），女（滿族），碩士生，研究方向為中藥制劑現(xiàn)代化。Te1：18832407574，E-mai1：zhang1iner_ 123 @ 163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81341143）；河北省高校重點學科建設(shè)項目資助（2012）

收稿日期：2015-06-16

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.025

中圖分類號：I284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0594-06