銀黃口服液近紅外光譜測定和相關性模型建立

張葉霞， 潘金火， 蔡寶昌， 秦昆明， 劉 曉，2， 王靨潤， 嚴國俊*（.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京2002；2.南京中醫(yī)藥大學，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心，江蘇南京2002；.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇南京2006）

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銀黃口服液近紅外光譜測定和相關性模型建立

張葉霞1， 潘金火1， 蔡寶昌2，3， 秦昆明3， 劉 曉1，2， 王靨潤1， 嚴國俊1*
（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心，江蘇南京210023；3.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇南京210061）

摘要：目的 近紅外光譜法測定銀黃口服液（金銀花、黃芩）中綠原酸和黃芩苷的含有量，并建立相關性模型用于定量分析。方法 采集30批銀黃口服液的近紅外光譜數(shù)據(jù)，HPLC和偏最小二乘法建立綠原酸和黃芩苷的相關性模型。結果 綠原酸和黃芩苷的最佳波段均為9 401.6～7 826 cm-1，I2分別為0.985 2和0.988 1，交叉驗證均方差（IMSECV）分別為0.002 96和0.018，相對分析誤差（IPD）分別為8.23和9.27。將該模型應用于檢測兩者的含有量時，其預測值的馬氏距離（Mash distance）均小于1，相對誤差分別為2.12%和1.67%。結論 該模型預測性良好，可用于銀黃口服液的實時監(jiān)測和質量控制。

關鍵詞：銀黃口服液；綠原酸；黃芩苷；相關性模型；近紅外光譜；HPLC；偏最小二乘

KEY W 0RDS：Yinhuang Ora1 Liquid；ch1orogenic acid；baica1in；dependency mode1；near-infrared spectroscopy；HPLC；partia11east squares

銀黃口服液由金銀花和黃芩提取物加工制成，收載于《中國藥典》2010版一部，具有清熱解毒，疏風利咽功效，臨床作用顯著。其作為液體制劑，是許多中成藥的中間體，如雙黃連口服液，清開靈注射液［1-2］等，故優(yōu)選其含有量測定方法對工業(yè)化生產具有重大意義。

近紅外光譜分析技術是光譜測量技術和化學計量學的結合，因其簡單可靠、快捷、無損，并可同時測定多組分，故可用于非破壞測定、在線分析等，迄今已應用于食品、藥品、農業(yè)［3-9］等多個領域，具有巨大的發(fā)展空間和經(jīng)濟效應，可實現(xiàn)質量源于控制的理念。過程分析技術［10-14］是目前制藥行業(yè)關注的熱點，該方法旨在設計、分析和控制藥品生產過程，通過及時測量原藥材生產時物料和工藝過程的關鍵質量和性能指標，以確保終端產品的質量。由于近紅外光譜技術無需對樣品進行復雜的前處理，分析時間短，故為過程分析技術的常用工具之一。

本實驗采用近紅外光譜法，對銀黃口服液進行定量分析，結合HPLC和偏最小二乘法，建立其主成分綠原酸和黃芩苷的相關性模型，從而為實現(xiàn)該藥物工業(yè)化生產的全程實時質量監(jiān)控提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 Waters 2000高效液相色譜儀，包括Waters 2996 DAD檢測器、Epower 2.0色譜工作站（美國Waters公司）。Bruker-Tensor37傅里葉變換中、近紅外光譜儀，包括OPUS 5.0光譜采集和處理軟件、Pbs檢測器（德國Bruker公司）；梅特勒MS-105DU電子分析天平（瑞士Mett1er-To1edo公司）。

乙腈、甲醇為色譜純；95%乙醇為化學純；甲酸、磷酸、鹽酸、乙酸、氫氧化鈉為分析純；娃哈哈純凈水。

1.2 實驗材料 綠原酸（批號110735-200212）、黃芩苷（批號110715-200212）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。金銀花、黃芩（江蘇海昇藥業(yè)有限公司）。共收集2個廠家不同批次的銀黃口服液，見表1。

表1 銀黃口服液的來源Tab.1 Sources of Yinhuang 0 ral Liquid

1.3 銀黃口服液的樣品制備

1.3.1 自制銀黃口服液 參照《中國藥典》2010版，按比例分別制得金銀花和黃芩提取物，均符合國家標準。

1.3.2 HPLC法樣品制備 取編號1～30的銀黃口服液各10 mL，置于離心機中，20 000 r/min高速離心10 min，取上清液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，密封冷藏保存。

1.3.3 NII法樣品制備 取“1.2”項下30個樣品，每個10 mL，置于10 mL量瓶中，搖勻，即得30批銀黃口服液樣品，密封冷藏保存。

1.4 綠原酸和黃芩苷的HPLC測定

1.4.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，12%～18%A；7～9 min，18%～28%A；9～16 min，28%～62%A；16～18 min，62%～100%A）；全波長掃描，綠原酸的檢測波長為327 nm，黃芩苷的檢測波長為280 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min。色譜圖見圖1。

圖1 銀黃口服液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Yinhuang 0 ral Liquid

1.4.2 標準曲線的制備 精密稱取綠原酸對照品6.26 mg，甲醇定容至10 mL，再取1 mL，甲醇定容至10 mL，得質量濃度為0.062 6 mg/mL的儲備液。再精密稱取黃芩苷對照品5.11 mg，甲醇定容至10 mL，得質量濃度為0.511 0 mg/mL的儲備液。

精密吸取上述對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL進樣，在“1.4.1”項色譜條件下測定。以各對照品進樣量（μg）為橫坐標（X），相應的峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得回歸方程分別為綠原酸Y＝923 757X-22 822（r＝0.999 9），黃芩苷Y＝3 069 553X-628 015（r＝0.999 9）。

結果表明，綠原酸和黃芩苷分別在0.125 2～1.252 μg、1.022～10.22 μg范圍內線性關系良好。1.4.3 精密度試驗 分別精密吸取每1 mL含綠原酸0.062 6 mg、黃芩苷0.511 0 mg的對照品溶液10 μL，進樣測定，連續(xù)6次。結果，兩者ISD分別為0.78%和0.92%，表明儀器精密度良好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液（批號131138）6份，按“1.3.2”項下方法制備樣品溶液，于0、2、4、8、16、24 h進樣10 μL，測定綠原酸和黃芩苷的含有量。結果，兩者ISD分別為2.0%和2.2%，表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

1.4.5 重復性試驗 取同一樣品溶液（批號131138）6份，按“1.3.2”項下方法制備樣品溶液，進樣測定。結果，綠原酸和黃芩苷的平均含有量分別為7.38 mg/mL（ISD＝1.8%）和28.55 mg/mL （ISD＝0.89%），表明該方法重復性良好。

1.4.6 加樣回收率試驗（表2） 精密稱取綠原酸、黃芩苷適量，用甲醇制成每1 mL含綠原酸0.121 mg和黃芩苷0.309 mg的混合對照品溶液。精密量取“1.3.2”項下批號為131138的銀黃口服液1 mL，共6份，分別置于2 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液1 mL，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置30 min，進樣測定。結果，兩者平均加樣回收率分別為96.1%（ISD＝1.1%）和97.4% （ISD＝1.7%），表明該方法加樣回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests

1.5 銀黃口服液近紅外光譜測定 掃描范圍14 000～3 900 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描16次，光程1 mm。平行3次，每次掃描30個樣品，共90次，見圖2。

圖2 銀黃口服液的近紅外圖譜Fig.2 Near-infrared image of Yinhuang 0 ral Liquid

2 結果與討論

2.1 HPLC測定 取“1.3.2”項下溶液，共30批，分別精密吸取10 μL進樣，測定各批次銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷的含有量范圍。結果見表3。

表3 綠原酸和黃芩苷的含有量范圍Tab.3 Content ranges of chlorogenic acid and baicalin

2.2 模型的建立與優(yōu)化 將已掃描的樣品光譜分成校正集和檢驗集兩組。由于預測樣品的濃度范圍必須在所建模型內，故檢驗集樣品從不同廠家和自制的銀黃口服液中隨機取樣，用以檢驗所建模型的效果。余下的樣品作為校正集樣品，用以建立不同成分的近紅外分析數(shù)學模型。

應用OPUS 5.0軟件，對原始光譜進行平滑處理，優(yōu)化用于建模的波段、光譜預處理方法，剔除預測值異常樣品，偏最小二乘法對校正集進行交叉檢驗，再采用留一法進行內部交叉驗證，確定模型主成分數(shù)，并對檢驗集樣品進行模型外部預測。評價指標采用決定系數(shù)（I2）、交叉驗證均方差（IMSECV）和相對分析誤差（IPD），獲得最佳光譜數(shù)據(jù)預處理方法、譜區(qū)范圍和優(yōu)化階，見表4。

表4 優(yōu)化模型參數(shù)Tab.4 Parameters for optim ized model

模型預測值與真實值的相關系數(shù)圖見圖3和圖4。

圖3 綠原酸預測值和真實值的相關系數(shù)圖譜Fig.3 Correlation coefficient im age of p redicted values and true values of chlorogenic acid

圖4 黃芩苷預測值和真實值的相關系數(shù)圖譜Fig.4 Correlation coefficient image of predicted values and true values of baicalin

由圖可知，預測值和真實值之間的線性相關十分顯著，表明該模型可有效表征銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷含有量的模型預測值與真實值。

2.3 模型穩(wěn)定性與預測效果評價

2.3.1 重復性試驗 取同一樣品溶液（批號131138）6份，在“1.5”項條件下測定，得到近紅外掃描圖，用模型預測其中綠原酸和黃芩苷的含有量。結果，兩者平均含有量分別為7.476 mg/mL（ISD＝0.96%）和29.03 mg/mL（ISD＝2.0%），表明該模型重復性良好。

2.3.2 日間精密度試驗 取同一樣品溶液（批號131138）1份，在“1.5”項條件下，于0、24、48、72、96、120 h測定，得到近紅外掃描圖，用模型預測其中綠原酸和黃芩苷的含有量。結果，兩者平均含有量分別為7.453 mg/mL（ISD＝1.9%）和28.87 mg/mL（ISD＝1.3%），表明在120 h內日間精密度良好。

2.3.3 模型預測效果的評價 為驗證上述模型的預測效果，將相關性模型用于預測余下樣本中綠原酸和黃芩苷的含有量。結果見表5和表6。

表5 綠原酸的預測值Tab.5 Predicted values of chlorogenic acid

表6 黃芩苷的預測值Tab.6 Predicted values of baicalin

其中，馬氏距離是指預測光譜與建模光譜平均主成分特征向量之間的距離，與所有建模光譜平均主成分特征向量之間的距離的比值，值越小，說明預測的可靠性越好。以上兩表中各樣品的馬氏距離均小于1，綠原酸和黃芩苷的ISD分別為2.1%和1.7%，說明預測結果十分可靠，所建立的銀黃口服液相關性模型預測性能良好，可用于在線監(jiān)測該藥物工業(yè)化大生產的實時含有量。

3 討論

本實驗采用近紅外光譜法測定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷的含有量，并結合HPLC和偏最小二乘法建立其相關性模型。結果顯示，該模型準確可靠，比HPLC法更快速、簡便、環(huán)保、準確，可為中藥制劑生產實時監(jiān)測提供可靠方法。

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Determ ination of Yinhuang 0 ral Liquid by near-infrared spectroscopy and establishment of dependency model

ZHANG Ye-xia1， PAN Jin-huo1， CAI Bao-chang2，3， QIN Kun-ming3， LIU Xiao1，2， WANG Yerun1， YAN Guo-jun1*
（I.School of Pharmacy，NanJing University of ChineseMedicine，NanJing 2IOO23，China；2.Engineering Research Center of StateMinistry of Education for Standardization of Chinese Materia Medica Processing，NanJing University of Chinese Medicine，NanJing 2IOO23，China；3.NanJing Haichang Chinese Medicine Co.，Ltd.，NanJing 2IOO6I，China）

ABSTRACT：AIM To determine the contents of ch1orogenic acid and baica1in in Yinhuang Ora1Liquid（Lonicera Japonica and Scutellaria baicalensis）by near-infrared spectroscopy and to estab1ish a dependencymode1 for quantitative ana1ysis.METH0DS Based on the near-infrared spectroscopy data of thirty batches of Yinhuang Ora1 Liquid，the dependencymode1 for ch1orogenic acid and baic1in was estab1ished by HPLC and partia11east squares. RESULTS 9 401.6 -7 826 cm-1served the bestwaveband for the detection of both ch1orogenic acid and baica-1in，0.985 2 and 0.988 1 were for I2，0.002 96 and 0.018 were for root-mean-squares error of cross-va1idation （IMSECV），and 8.23 and 9.27 were for regression point disp1acement（IPD），respective1y.When thismode1 was used for the determination of these two constituents，the predicted Mash distance va1ues of both constituentsbook=566,ebook=100were 1ess than 1，whose re1ative errorswere 2.12% and 1.67%，respective1y.C0 NCLUSI0 N With good predictabi1ity，thismode1 can be app1ied to the rea1 timemonitoring and qua1ity contro1of Yinhuang Ora1Liquid.

*通信作者：嚴國?。?980—），男，副教授，研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)及評價。Te1：13770598093，E-mai1：joun.yan@163.com

作者簡介：張葉霞（1991—），女，碩士生，研究方向為新藥劑型與開發(fā)。Te1：15805171380，E-mai1：15805171380@163.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（81202922）；江蘇省科技支撐計劃工業(yè)項目（BE2012011）；江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK2012089）

收稿日期：2015-05-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.018

中圖分類號：I927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0565-05