調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應(yīng)激干預(yù)的研究?

古宇能，陳慰填，溫志鵬△，曾楊玲，陳德寧

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳518033;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006)

調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應(yīng)激干預(yù)的研究?

古宇能1，陳慰填1，溫志鵬1△，曾楊玲2，陳德寧1

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳518033;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006)

目的:觀察經(jīng)驗(yàn)方“調(diào)肝活血湯”聯(lián)合palomo手術(shù)對精索靜脈曲張癥患者精漿氧化應(yīng)激的影響。方法:選取99名精索靜脈曲張癥相關(guān)不育患者分成3組。試驗(yàn)組(G1)采用調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)治療，中藥對照組(G2)單獨(dú)采用調(diào)肝活血湯口服，手術(shù)對照組(G3)采用palomo手術(shù)共6個(gè)月，觀察治療前后精液質(zhì)量和精漿ROS、NO、SOD、TAC的變化情況。結(jié)果:試驗(yàn)組精液質(zhì)量和精漿TAC、SOD水平顯著改善;ROS和NO有所降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo術(shù)能干預(yù)精漿中氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而提高精液質(zhì)量。

調(diào)肝活血湯;palomo手術(shù);精索靜脈曲張癥;氧化應(yīng)激

男性不育癥是讓眾多家庭深感苦惱的疾病，也是男科學(xué)研究的重要領(lǐng)域［1］。臨床常見類型為先天性生殖器官畸形、性功能障礙、精液質(zhì)量下降等，其中弱精子癥、少精子癥及精子形態(tài)異常是最主要的原因。精索靜脈曲張癥(varicocele，VC)是與不育癥相關(guān)的重要疾病，這在20世紀(jì)50年代就得到證實(shí)［2］。傳統(tǒng)治療VC多采用手術(shù)或者藥物栓塞，效果有限且并發(fā)癥多。筆者采用經(jīng)驗(yàn)方“調(diào)肝活血湯”聯(lián)合經(jīng)典術(shù)式——Palomo術(shù)治療VC相關(guān)不育癥，并開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下并對其機(jī)理作一探討。

1 臨床資料

1.1 病例選擇

選取2012年11月至2014年9月在深圳市中醫(yī)院男科門診就診的不育癥患者99例，男性年齡最大46歲，最小27歲，平均年齡32歲;病程最短1年，最長4年，平均病程2年6個(gè)月。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)精索靜脈曲張分度標(biāo)準(zhǔn):按照曲張程度由輕到重劃為4個(gè)等級［3］:①亞臨床型:體檢為陰性，超聲在平靜呼吸狀態(tài)下探及精索靜脈內(nèi)無返流，做Valsalva動(dòng)作時(shí)有返流，DR: 1.8～2.1 mm，TR:1～2 s;②精索靜脈曲張Ⅰ級:體檢觸診為陽性，做Valsalva動(dòng)作時(shí)有返流，平靜呼吸時(shí)DR:2.2～2.7 mm，TR:2～4 s;③精索靜脈曲張Ⅱ級:體檢觸診陽性，做Valsalva動(dòng)作時(shí)有返流，DR:2.8～3.1 mm，TR:4～6 s;④VCⅢ級:觸診呈陽性，平靜呼吸時(shí)DR≥3.1 mm，TR≥6 s，做Valsalva動(dòng)作時(shí)返流明顯。男性不育癥標(biāo)準(zhǔn):參考《WTO人類精液及精子—宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)手冊》(第五版):育齡夫妻婚后同居1年以上，性生活正常而未采用任何避孕措施，由于男性方面原因造成女方不孕者;精子濃度＜15×106/ml為少精子癥;前向運(yùn)動(dòng)精子比例＜32%為弱精子癥。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》精索靜脈曲張證型制定:肝氣郁結(jié)證:癥見精索靜脈擴(kuò)張，陰囊下垂，煩躁，情緒波動(dòng)易怒，胸脅脹痛，腹部脹滿，舌紅苔黃，脈弦;氣滯血瘀證:精索靜脈擴(kuò)張、盤曲成團(tuán)，陣發(fā)性脹痛或刺痛，久站或勞累后加重，舌暗有瘀斑，脈弦細(xì)［4］。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn)符合男性不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn);符合肝氣郁結(jié)證或氣滯血瘀證者;CASA檢測確定同時(shí)為少精子癥和弱精子癥者;單側(cè)Ⅱ度以上精索靜脈曲張或雙側(cè)I度以上精索靜脈曲張患者。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)藥物過敏者;年齡在20歲以下或55歲以上;具有泌尿生殖系統(tǒng)炎癥、先天生殖器官畸型、勃起功能障礙或早泄、染色體異常者;具有嚴(yán)重的慢性疾病如肝硬化、肺結(jié)核、惡性腫瘤、心肌梗死者;患者配合度差，可能無法遵醫(yī)囑完成研究全過程者;具有不良嗜好如酗酒、熬夜，或服用對精子有明確影響的藥品者;長期工作在高輻射、高溫環(huán)境者。

1.2.5 脫落標(biāo)準(zhǔn)用藥過程中發(fā)生明顯身體不適或嚴(yán)重不良反應(yīng)中出現(xiàn)并發(fā)癥;或因出現(xiàn)新的疾病不合適繼續(xù)接受試驗(yàn)者。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)方案。根據(jù)區(qū)組隨機(jī)化原則，將接收研究的患者編為33個(gè)區(qū)組，將每一區(qū)組的3位患者各自分配到試驗(yàn)組(G1)和中藥對照組(G2)、手術(shù)對照組(G3)，這樣可以避免研究時(shí)間較長導(dǎo)致的非同期對照偏倚及組間人數(shù)差異過大。

2.2 治療方法

2.2.1 G1組(試驗(yàn)組)采用經(jīng)皮小切口腹膜外超選擇性精索內(nèi)靜脈高位結(jié)扎術(shù)(高位血管集束結(jié)扎法)。手術(shù)方式:定位在髂前上嵴內(nèi)側(cè)約3 cm，平行于腹股溝韌帶，取內(nèi)環(huán)上方3 cm開口，長約2～3 cm。先切開皮膚，逐步分離至后腹膜腔，然后打開精索筋膜，尋找固定精索內(nèi)靜脈大約3～4 cm，切斷后兩斷端雙重結(jié)扎。探查陰囊，尋找剩余充盈的精索內(nèi)靜脈分支并逐一縫扎細(xì)小的靜脈分支。最后用4號絲線皮內(nèi)美容縫合皮膚切口，不拆線。術(shù)后3 d開始口服經(jīng)驗(yàn)方“調(diào)肝活血湯”:柴胡10 g，白芍20 g，桔梗10 g，枳殼20 g，牛膝10 g，橘核10 g，桃仁10 g，紅花5 g，當(dāng)歸10 g，生地10 g，川芎5 g，水蛭5 g。中藥飲片由深圳和順堂藥業(yè)有限公司提供，深圳市中醫(yī)院制劑室按照常規(guī)煎藥方法制作)，治療時(shí)間為6個(gè)月。治療結(jié)束后連續(xù)隨訪3個(gè)月。

2.2.2 G2組(中藥對照組)口服“調(diào)肝活血湯”每日1劑，分2次服，治療時(shí)間為6個(gè)月，治療結(jié)束后連續(xù)隨訪3個(gè)月。

2.2.3 G3組(手術(shù)對照組)單獨(dú)采用Palomo術(shù)，手術(shù)后按常規(guī)方式抗菌消炎，給予一定營養(yǎng)支持，不適用任何可能對生育有影響的藥物及理療方式，術(shù)口愈合后出院，1個(gè)月內(nèi)不做劇烈運(yùn)動(dòng)，隨訪3個(gè)月。

2.3 觀察指標(biāo)

治療前后分別檢測精液質(zhì)量分析(CASA)，記錄精液常規(guī)指標(biāo)(精子密度、前向精子比例、精子活動(dòng)率、畸形率);測定活性氧(reactive oxy-gen species，ROS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)水平，記錄治療前后和治療過程中的臨床癥狀，進(jìn)行血、尿、糞常規(guī)化驗(yàn)和肝、腎功能檢查。

2.4 檢驗(yàn)方法

2.4.1 精液收集患者禁欲2～7 d，自慰或女方幫助手淫取得精液置于專用容器中，再保存于37℃溫箱中，30 min后上機(jī)檢查。

2.4.2 精液常規(guī)參數(shù)測定采用北京偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(BJWL 9000)，分析精子密度、精液量、精子活動(dòng)率、前向精子比例，標(biāo)準(zhǔn)參考世界衛(wèi)生組織推薦的指南。

2.4.3 精子畸形指數(shù)采用Diff-Quik法染色檢測。

2.4.4 精漿ROS測定精液ROS水平用化學(xué)發(fā)光法檢測。400 μL完全液化后的精液加入一次性照度計(jì)容器內(nèi)，取4 μL魯米諾儲(chǔ)存液，同時(shí)加入8 μL辣根過氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根過氧化物酶，310 U/mg)。使用Berthold照度計(jì)檢測化學(xué)發(fā)光信號約5 min直至達(dá)到穩(wěn)定。為平衡精子密度對各組ROS水平帶來的混雜作用，按照下式計(jì)算調(diào)整各組ROS水平:平衡精子密度后的ROS水平=相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(RLU/s)×20×106/精子密度(精子數(shù)/ml)×0.4 ml，計(jì)算后的ROS單位為RLU/s每20×106精子。

2.4.5 精漿TAC的測定精漿中總抗氧化能力可用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法來測定。冷凍的精漿樣品在室溫下解凍后立即進(jìn)行TAC測量。精漿用去離子水(dH2O)1∶20稀釋后0.20 um濾器過濾。信號試劑的配制:30 ul H2O2(8.8 mol/L)，10 ul對-碘酚儲(chǔ)備液(41.72 umol/L)，110 ul魯米諾儲(chǔ)備液(3.1 mmol/L)，10 ml Tris緩沖液(0.1 mol/L pH8.0)。HRP工作液的配制是將HRP儲(chǔ)備液按1∶1用dH2O稀釋產(chǎn)生3×107cpm的化學(xué)發(fā)光值。

2.4.6 SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定精漿中SOD活力。冷凍的精漿在室溫下解凍至4℃作為待測樣品。WST-1可與黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生的超氧化物陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲染料，該反應(yīng)步驟可以被SOD所抑制。通過對WST-1產(chǎn)物的比色分析即可計(jì)算SOD酶活力。

2.4.7 NO測定采用比色法，收集解凍的精漿，酶標(biāo)儀550 nm處測吸光度值，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔取均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔作出亞硝酸鉀濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣品孔吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得各樣孔濃度，記作精漿中NO水平。以上檢驗(yàn)由深圳市中醫(yī)院臨床細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室測定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0 for windows計(jì)算軟件先進(jìn)行方差齊性分析，等級資料采用Ridit檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析，并進(jìn)一步作兩兩比較，組內(nèi)前后采用配對檢驗(yàn)，脫落病例采用末次觀測結(jié)轉(zhuǎn)法填補(bǔ)缺失數(shù)據(jù)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組精液質(zhì)量和精子畸形率比較

表1顯示，G1組、G2組、G3組治療后精子畸形率、精子密度、前向精子運(yùn)動(dòng)比例、精子活動(dòng)率均優(yōu)于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療后G1組與G2、G3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G1組為佳(P＜0.05)。

表1 各組治療前后精液質(zhì)量、精子畸形率比較(±s)

表1 各組治療前后精液質(zhì)量、精子畸形率比較(±s)

注:與治療前比較:△P＜0.05;與G2組比較:▲P＜0.05;與G3組比較:●P＜0.05

組別例數(shù)時(shí)間精子密度(×106/ml)前向運(yùn)動(dòng)精子比例(%)精子活動(dòng)率(%)精子畸形率(%) G1組33治療前10.19±2.24 13.08±2.40 21.62±3.58 74.71±9.04治療后54.13±4.76△▲●42.53±1.18△▲●51.34±6.07△▲●32.25±6.3△▲●G2組33治療前10.26±1.90 14.37±2.71 20.97±3.58 74.46±9.24治療后37.44±3.06△27.94±3.58△36.49±1.87△54.09±6.14△G3組33治療前10.26±1.46 13.97±2.70 20.54±4.53 73.61±6.83治療后32.58±2.17△28.42±3.06△37.83±4.62△50.18±5.03△

3.2 各組ROS、NO、SOD、TAC水平

表2顯示，G1組、G2組、G3組治療后與治療前比較精漿ROS、NO均有所降低，SOD、TAC水平有所提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療后G1組與G2、G3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G1組為佳(P＜0.05)。

表2 各組精漿ROS、NO、SOD、TAC水平比較(±s)

表2 各組精漿ROS、NO、SOD、TAC水平比較(±s)

注:與治療前比較:△P＜0.05;與G2組比較:▲P＜0.05;與G3組比較:●P＜0.05

組別例數(shù)時(shí)間ROS(RLu/S)NO(μmol/L)SOD(U/ml)TAC(U/L) G1組33治療前38.15±1.02 78.95±3.01 8.36±4.02 24.65±0.25治療后25.23±2.21△▲●45.21±4.23△▲●12.28±0.38△▲●36.69±2.47△▲●G2組33治療前36.22±1.21 75.18±3.25 9.89±3.69 24.18±1.32治療后30.25±2.82△58.36±4.51△10.54±4.55△30.28±0.41△G3組33治療前38.63±2.36 74.85±3.11 8.19±4.26 24.54±0.99治療后29.65±2.53△49.22±4.01△10.48±4.87△31.56±0.45△

3.3 不良事件和不良反應(yīng)

3組肝、腎功能均未見異常;血、尿、糞化驗(yàn)正常;G3組有1例患者術(shù)后3 d出現(xiàn)術(shù)口紅腫，給予抗菌消炎及遠(yuǎn)紅外燈治療后恢復(fù)正常。

3.4 隨訪

試驗(yàn)結(jié)束后電話隨訪，未發(fā)現(xiàn)與藥物有關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

3.5 脫落病例

所有患者都遵從要求完成試驗(yàn)，未見脫落病例。

4 討論

中醫(yī)稱精索靜脈曲張癥為“筋瘤”“筋疝”或“偏墜”，是指精索蔓狀靜脈叢發(fā)生擴(kuò)張、伸長及迂曲，原因可能是血管瓣膜功能不健全、靜脈回流受阻、血液返流、瘀滯等［5］。精索靜脈曲張為泌尿系統(tǒng)中的常見疾病，好發(fā)于左側(cè)，青壯年多見，且對睪丸的損害呈雙側(cè)性［6］。VC具有家族遺傳傾向性，發(fā)病率可隨年齡的增長而升高［7］。在男性不育癥的諸多因素中精索靜脈曲張是一種常見原因，特別是臨床III級曲張，常引起少精子、弱精子癥甚至睪丸萎縮。病理研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張會(huì)導(dǎo)致睪丸中氧自由基濃度和一氧化氮(NO)濃度升高，腎臟及腎上腺毒素滯留;睪丸瘀血、缺氧引起睪丸微循環(huán)障礙［8］;干擾血清生殖激素的分泌，造成睪酮下降、泌乳素升高，從而導(dǎo)致精子生成與成熟障礙［9］。

氧化應(yīng)激(Oxidativestress，OS)是指當(dāng)氧化物含量超過抗氧化物含量，從而形成的過氧化產(chǎn)物增多引起的一系列病理現(xiàn)象。最新研究發(fā)現(xiàn)，精漿氧化應(yīng)激水平與VC嚴(yán)重程度存在正相關(guān)［10］。精子在睪丸精曲小管生發(fā)與分化過程中需要保持氧化與抗氧化生理性平衡，而VC造成精漿氧化應(yīng)激并打破了這種平衡。適當(dāng)?shù)难趸磻?yīng)可清除睪丸中衰老、結(jié)構(gòu)缺陷的精子細(xì)胞，對種族繁衍具有積極意義。但氧化應(yīng)激則導(dǎo)致精子活力減弱、頂體反應(yīng)受損、精子DNA損傷等，從而損害了男性的生殖能力。一氧化氮代謝紊亂和活性氧含量升高是2種常見的氧化應(yīng)激病理機(jī)制。人類精漿存在一整套抗氧化防御機(jī)制，使精子免于氧化攻擊，保護(hù)精子的正常代謝，其中酶類抗氧化物如超氧化物歧化酶是重要的武器，如果抗氧化因子減少會(huì)促使氧化應(yīng)激的發(fā)生。所以本課題引入ROS、NO、SOD作為重點(diǎn)觀測對象，并通過檢測精漿中總抗氧化能力來評價(jià)試驗(yàn)效果。

精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)是應(yīng)用于治療VC的常用手段，Palomo術(shù)為改良型術(shù)式，療效得到一致肯定。但手術(shù)仍然具有一定風(fēng)險(xiǎn)，包括感染、出血過多、誤傷輸精管等，術(shù)后需要較長恢復(fù)時(shí)間，容易并發(fā)睪丸鞘膜積液、急性附睪炎、自身免疫性損傷等;加上患者對手術(shù)的顧慮使該方法應(yīng)用受到限制［11］。探索中西醫(yī)結(jié)合方式，取長補(bǔ)短，既可以增加療效，又可以減少并發(fā)癥，或許是一種行之有效的途徑。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是單獨(dú)采用調(diào)肝活血湯、palomo手術(shù)治療還是調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)治療，患者精子密度都有所增加，提高了前向精子比例和精子活動(dòng)率，精子畸形率有所減少，顯示3組治療方法都能改善患者的精液質(zhì)量。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)組療效優(yōu)于對照組;各組治療后精漿ROS、NO水平下降，說明該治療方案有效降低了睪丸中的氧化應(yīng)激;SOD、TAC的增加，提示治療后患者精漿的抗氧化能力有所增強(qiáng)，生精上皮功能得到保護(hù)。同樣試驗(yàn)組療效優(yōu)于對照組，顯示了中西醫(yī)結(jié)合治療具有一定的優(yōu)勢，比單純中藥治療或手術(shù)治療更能減輕氧化應(yīng)激損傷。其原理可能有以下幾方面:一是緩解精索靜脈內(nèi)血液瘀阻現(xiàn)象，降低睪丸溫度。本試驗(yàn)用藥為清代名醫(yī)王清任的經(jīng)典名方血府逐瘀湯為基本方加減而成，具有活血化瘀不傷血、疏肝解郁而不耗氣的特點(diǎn)，使得“肝脈條達(dá)，氣血平正”。加上手術(shù)改變了血流動(dòng)力學(xué)，消除了返流，為精子生長與分化提供了較好的環(huán)境。二是應(yīng)用中藥可加快術(shù)后精索靜脈側(cè)枝循環(huán)的建立，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收與代謝，減輕了術(shù)后陰囊水腫以及自身免疫損傷等并發(fā)癥。三是應(yīng)用活血化瘀中藥能改變血液高凝狀態(tài)，改善睪丸和附睪的微循環(huán)，防止性腺分泌管道阻塞，這是單獨(dú)手術(shù)所不能做到的。實(shí)驗(yàn)證明，調(diào)肝活血湯聯(lián)合palomo手術(shù)法還可以緩解VC患者陰囊脹痛、潮濕等癥狀以及由此產(chǎn)生的焦慮、抑郁，是一種值得推廣的方法。而不足之處為研究時(shí)間有限，樣本量還不夠大，以后可以增加樣本含量，從多中心多靶點(diǎn)進(jìn)一步深入研究分析。

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Observation of TiaoGanHuoXue Decoction Combined with Palomo Operation on the Oxidativestress in the Patients with Varicocele

GU Yu-neng1，CHEN Wei-tian1，WEN Zhi-Peng1△，ZENG Yang-lin2CHEN De-ning1
(1.Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenzhen 518033，Guangdong，China; 2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China)

objective:To observe the efficacy of TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation on the oxidativestress in the patients with Varicocele Methods:Nighty-night patients with Infertility caused by varicocele were randomly divided into three groups.The G1treatment group treated with TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation.The G2control group treated with TiaoGanHuoXue decoction and the G3control group treated with Palomo operation.The therapeutic efficacy and the content of ROS、NO、SOD、TAC were evaluated after six months.Results:The treatment group showed a better effect than two control groups in improving sperm quality.The content of TAC and SOD was increased and the content of ROS and NO was decreased.Conclusion:TiaoGanHuoXue decoction combined with Palomo operation could improve the sperm quality for the patients with Oligoasthenozoospermia by improving oxidativestress.

TiaoGanHuoXue decoction;Palomo operation;Varicocele;Oxidativestress

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0651-04

2015-10-06

2012年深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201202156)-精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)聯(lián)合調(diào)肝活血湯對VC患者精液質(zhì)量的影響和精漿氧化應(yīng)激干預(yù)的研究

古宇能(1979-)，男，廣東梅州人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事泌尿男科的臨床與研究。

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:溫志鵬，Tel:13713940819。