益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病腎病大鼠腎組織WT1影響的實驗研究?

宋純東，張霞△，宋丹丹，薛黎明，任瑞英，楊曉麗，侯小靜

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州450008;2.鄭州市第三人民醫(yī)院，鄭州450000; 3.河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，鄭州450003;4.鄭州市兒童醫(yī)院，鄭州450005; 5.河南鄭州市金水區(qū)人民醫(yī)院，鄭州450000;6.鄭州市中醫(yī)院，鄭州450000)

益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病腎病大鼠腎組織WT1影響的實驗研究?

宋純東1，張霞1△，宋丹丹2，薛黎明3，任瑞英4，楊曉麗5，侯小靜6

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州450008;2.鄭州市第三人民醫(yī)院，鄭州450000; 3.河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，鄭州450003;4.鄭州市兒童醫(yī)院，鄭州450005; 5.河南鄭州市金水區(qū)人民醫(yī)院，鄭州450000;6.鄭州市中醫(yī)院，鄭州450000)

目的:探討益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病腎病(DN)大鼠腎組織WT1表達的影響。方法:大鼠喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組并建立DN大鼠模型。造模成功后空白組和模型組灌服生理鹽水，中藥組灌服益氣養(yǎng)陰活血方顆粒劑，8周后生化檢測24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等;測量腎小球直徑，稱取左腎質(zhì)量、計算肥大指數(shù);PAS染色觀察大鼠腎臟病理;免疫組化檢測腎組織WT1表達。結(jié)果:益氣養(yǎng)陰活血方能夠上調(diào)實驗大鼠腎組織WT1的表達，減少24 h尿蛋白、Scr及BUN水平，升高ALB，縮小腎小球直徑，改善腎臟病理。結(jié)論:益氣養(yǎng)陰活血方可能通過影響DN大鼠腎組織WT1的表達而改善上述生化指標，減輕腎臟病理損害，對肝功能未見明顯損害。

糖尿病腎病;益氣養(yǎng)陰活血方;WT1;實驗研究

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，尿蛋白是DN發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，足細胞是DN蛋白尿的形成和發(fā)展的重要參與者，早期糖尿病腎臟足細胞數(shù)量即可減少［1］。腎母細胞腫瘤1(WT1)是足細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，WT1-C末端多克隆抗體(WT1-C)表達在足細胞的細胞核，可作為足細胞的標記蛋白［2-4］，提示DN發(fā)生時腎臟足細胞WT1的表達減少。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，“益氣養(yǎng)陰活血方”有降低蛋白尿的作用［5］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，該方可能通過影響TGF-β1/ p38MAPK［6］、Smad2［7］、JAK2/STAT3［8］等通路而改善DN模型大鼠腎臟病理。本研究旨在觀察本方對DN大鼠腎臟足細胞WT1表達的影響與降低蛋白尿、改善腎臟病理的相關(guān)性，為臨床應(yīng)用進一步提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物

益氣養(yǎng)陰活血方顆粒由生黃芪、生地、菟絲子、積雪草、炙大黃、水蛭組成，藥材由四川新綠色藥業(yè)科技有限公司提供并加工為顆粒劑。

1.2 試劑

兔抗大鼠WT1一抗購于Sant Cruz公司;生物素標記山羊抗兔IgG及DAB顯色劑購于中杉金橋生物有限公司。

1.3 造模及分組

清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(200±20) g，由河南省實驗動物中心提供(許可證號SCXK (豫)2010-0002)。按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組3組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后模型組和中藥組應(yīng)用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)45 mg/kg單次腹腔注射，空白組給予同等劑量新鮮配制的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，3 d后連續(xù)監(jiān)測血糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖陽性，尿蛋白陽性，尿量大于正常組150%者為造模成功。

1.4 給藥方法及劑量

空白組和模型組灌服生理鹽水(1 ml/100 g)，中藥劑量按照成人用藥劑量(按體質(zhì)量60 kg計算)的12.5倍(22.30 g/kg)，共給藥6周。

1.5 觀察指標

1.5.1 生化指標檢測灌胃第6周末禁食不禁水，代謝籠留取24 h尿液，雙縮脲法測定24 h尿蛋白定量;于第2天麻醉后股動脈取血2 ml，AU800全自動生化分析儀檢測ALT、ALB、BUN、Scr和血糖。

1.5.2 腎臟病理檢測處死大鼠，切取左側(cè)腎臟去除被膜迅速稱量;取右腎少量組織常規(guī)制片，PAS染色，光鏡下放大400倍觀察腎臟病理，測量腎小球直徑、腎小管短徑距離來判斷腎小球肥大程度和腎小管的腫脹程度。測量方法:光鏡下淺層皮質(zhì)區(qū)隨機取10個腎小球，用圖像分析系統(tǒng)測量腎小球直徑并取平均值;避開腎小球和細小動脈隨機取10個腎小管視野，計算完整腎小管數(shù)目，用圖像分析系統(tǒng)測量每個完整腎小管的短徑距離，取平均值。

1.5.3 免疫組化(IHC)檢測按試劑盒操作說明檢測腎組織WT1的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS Version 19.0 for W indows進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標

表1顯示，ALB:中藥組較模型組升高(P＜0.01);ALT、BUN、Scr:3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);24 h尿蛋白定量:中藥組較模型組降低(P＜0.01);空白組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 大鼠肝、腎功能、尿蛋白的變化(±s)

表1 大鼠肝、腎功能、尿蛋白的變化(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:ΔΔP＜0.01

組別鼠數(shù)ALB(g/L)ALT(U/L)Scr(umol/L)BUN(mmol/L)24 h尿蛋白(g/24 h)空白組11 24.10±1.75 87.36±16.43 41.79±4.80 8.87±0.97 0.0371±0.0166模型組10 16.99±0.69＊＊105.10±29.24 43.91±10.81 10.24±1.88 0.1818±0.0372＊＊中藥組8 21.80±1.16ΔΔ85.00±30.93 39.46±3.98 8.28±2.66 0.0553±0.0075ΔΔ

2.2 腎臟外觀及病理

圖1顯示，空白組肉眼看腎臟大小、癥狀正常，色暗紅，表面光滑，包膜易剝離且無黏連。光鏡下腎小球結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見肥大，腎小球毛細血管基底膜、系膜及其基質(zhì)未見異常改變。模型組肉眼看腎臟體積增大，光鏡下可見腎小球彌漫性肥大，腎小球毛細血管基底膜彌漫增厚、僵直，系膜區(qū)增寬，系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增多，部分足細胞、壁層上皮細胞肥大而少數(shù)脫落。中藥組病理改變程度相對較輕。

圖1 PAS染色法觀察腎小球體積、腎臟病理(×400)

2.3 大鼠腎組織WT1蛋白的表達

圖2表2顯示，WT1在腎小球臟層上皮細胞表達，腎小管內(nèi)無表達。免疫組化結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組WT1表達減少(P＜0.01)，與模型組比較，中藥組增多(P＜0.01)。

圖2 免疫組化法檢測W T1在腎小球臟層上皮細胞表達(×400)

表2 各組大鼠腎小球體積與腎組織中W T1蛋白表達的比較(±s)

表2 各組大鼠腎小球體積與腎組織中W T1蛋白表達的比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:ΔΔP＜0.01

組別鼠數(shù)腎小球體積WT1蛋白表達空白組11 101.58±9.91 15.81±1.21模型組10 186.93±16.19＊＊8.14±0.87＊＊中藥組8 132.86±7.32ΔΔ13.46±0.92ΔΔ

3 討論

DN的主要病理特征是腎小球細胞外基質(zhì)堆積、系膜增寬、基底膜增厚、腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，然而這些因素僅能解釋30%～50%的尿蛋白排泄率和腎小球濾過率的變化［2］。研究表明，WT1基因的破壞可導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)展［9-10］，蛋白的形成也受WT1基因的調(diào)節(jié)［11］，因此DN蛋白尿與WT1基因的表達密切相關(guān)。足細胞是DN蛋白尿形成和發(fā)展的重要參與者，當足細胞大量丟失、數(shù)目減少時會產(chǎn)生大量蛋白尿。研究發(fā)現(xiàn)，在腎小球的3種細胞中，WT1只在足細胞核表達，因而WT1可以作為足細胞胞核的標記。DN出現(xiàn)最早、最明顯的腎臟病理變化為腎臟肥大，也是導(dǎo)致腎小球硬化的重要因素。而衡量腎臟肥大的客觀指標是腎重/體質(zhì)量指數(shù)，它可以在排除體質(zhì)量影響的情況下對腎重進行觀察。

益腎養(yǎng)陰活血方是依據(jù)中醫(yī)“久病必虛”“久病必瘀”“久病入絡(luò)”的理論，以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主要功效，方藥由生黃芪、生地黃、菟絲子、積雪草、大黃、水蛭組成，臨床觀察對早期DN療效肯定［5］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪有保護腎小管作用;生地有改善腎功能、抗血小板聚集等作用;菟絲子有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用;積雪草提取物具有抑制成纖維細胞增殖的作用;大黃能夠減少尿蛋白，改善脂肪、糖、蛋白質(zhì)代謝的紊亂;水蛭有改善腎臟微循環(huán)、防止腎小球硬化、保護腎功能的作用。諸藥共奏益腎養(yǎng)陰、活血化瘀之效，寒溫并用，補瀉兼施，可使腎元得補、瘀濁得除、標本兼顧而諸癥自愈。

本研究結(jié)果顯示，模型組腎重/體質(zhì)量指數(shù)較空白組明顯增加，說明造模組大鼠腎臟肥大，符合DN早期的病理變化。中藥組腎臟肥大指數(shù)明顯低于模型組，且ALB明顯升高，尿蛋白明顯降低，腎組織WT1明顯增加，但ALT、Scr、BUN較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明益氣養(yǎng)陰活血方可以有效抑制腎臟肥大，改善腎臟病理，減少蛋白尿，升高血漿白蛋白，且對谷丙轉(zhuǎn)氨酶、腎功能無影響。上述結(jié)果表明，經(jīng)中藥復(fù)方干預(yù)治療后，模型大鼠腎組織WT1蛋白表達與尿蛋白成負性相關(guān)，說明中藥復(fù)方具有保護DN大鼠足細胞的功能，同時可減少蛋白尿、升高ALB、改善腎臟病理等作用，并具有安全性，此可能是益氣養(yǎng)陰活血方治療DN的另一有效機制。

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2015-09-24

河南省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)專項資助項目(2013ZY0301);河南省科技攻關(guān)重點項目(142102310284);河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項課題普通項(2013ZY02065)

宋純東(1967-)，男，河南民權(quán)人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事腎小球疾病的中西醫(yī)診治機制研究。

△通訊作者:張霞(1978-)，女，浙江景寧人，副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事腎小球疾病的中西醫(yī)臨床與研究，E-mail:ardar123@sina.com。