番茄連作與輪作土壤生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)的比較

楊尚東，李榮坦，吳俊，郭伊娟，龍明華.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院//廣西甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，廣西 南寧 530007

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番茄連作與輪作土壤生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)的比較

楊尚東1,2，李榮坦1，吳俊1，郭伊娟1，龍明華1
1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院//廣西甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，廣西 南寧 530007

摘要：隨著全國番茄（Lycopersicon esculentum）的規(guī)?；a(chǎn)以及形成相對固定的生產(chǎn)區(qū)域，番茄連作障礙現(xiàn)象逐年嚴重。文章針對番茄連作、輪作土壤的生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)展開了分析，旨在揭示連作與輪作土壤中生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為保障番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。試驗分別設(shè)置番茄-番茄、番茄-茄子（Solanium melongena）、番茄-辣椒（Capsicum annuum）連作和番茄-黃瓜（Cucumis sativus L.）、番茄-白菜（Brassica campestris L.）、番茄-菜豆（Phaseolus vulgaris）輪作共6個處理。采用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）以及稀釋平板法等現(xiàn)代和傳統(tǒng)分析技術(shù)，比較分析了連作和輪作不同蔬菜作物對土壤生物學(xué)性狀和細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：番茄連作導(dǎo)致土壤可培養(yǎng)細菌、放線菌數(shù)量顯著降低，真菌數(shù)量顯著增加，微生物群落由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)變；同時連作還導(dǎo)致土壤中指示土壤肥力的微生物生物量碳、氮和涉及碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性顯著降低；此外，番茄連作導(dǎo)致土壤細菌多樣性指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（EH）和豐富度指數(shù)（S）下降，番茄連作土壤中主要以不可培養(yǎng)細菌（Uncultured bacterium）為優(yōu)勢種屬。相比之下，番茄輪作不僅能顯著增加微生物數(shù)量，提高土壤微生物生物量碳、氮和酶活性，而且輪作土壤中除了維持較高的細菌多樣性之外，還出現(xiàn)假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）等促生細菌種屬。表明番茄輪作有利于提高土壤肥力和保持土壤健康。其中，番茄輪作黃瓜、白菜和菜豆3種不同科屬蔬菜作物中，以輪作菜豆更有利于提高土壤肥力和保持土壤健康。

關(guān)鍵詞：番茄；連作；細菌群落結(jié)構(gòu)；生物學(xué)性狀；PCR-DGGE

YANG Shangdong,LI Rongtan,WU Jun,GUO YiJuan,LONG Minghua.Comparison of Soil Microbial Properties and Bacterial Community Structure in Continuous Cropping and Rotation Fields of Tomatoes [J].Ecology and Environmental Sciences,2016,25(1):76-83.

番茄（Lycopersicon esculentum）是廣西主要茄果類蔬菜之一。近年來，隨著廣西番茄生產(chǎn)逐步向規(guī)?；?、效益化方向發(fā)展，特別是無公害蔬菜基地項目的實施，使廣西番茄產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐年擴大，目前年播種面積已達5.07×104hm2，而且300 hm2以上連片的番茄產(chǎn)區(qū)已屢見不鮮。然而隨著番茄規(guī)?；图s化生產(chǎn)的逐年加大，病蟲害的發(fā)生也越來越嚴重。近年來，連作障礙、青枯病和晚疫病等病害所造成的損失正逐年增加，嚴重阻礙來了廣西番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（李文嘉等，2011；王益奎等，2011）。

其中，連作障礙發(fā)生的原因一方面與土壤傳染性病害、土壤理化性狀劣變以及由根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用等有關(guān)，而這些因子均不同程度地與土壤中的微生物有關(guān)（雷娟利等，2005）。另一方面，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的多樣性與均勻性不僅可提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與和諧性，同時也可提高對土壤微生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力（吳鳳芝等，2007）。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量及其健全性（吳鳳芝等，2010），同時也是克服連作障礙及其他土壤障礙因子的關(guān)鍵所在（吳鳳芝等，2008）。土壤中存在著大量的微生物，其中以細菌的種類和數(shù)量最多（賈志紅等，2010）。近年來有關(guān)微生物培養(yǎng)、不同栽培方式及自毒物質(zhì)對作物土壤微生物多樣性影響的研究報道較多（王光華等，2008；胡元森等，2007），但有關(guān)不同栽培方式即蔬菜輪作對番茄連作土壤生物學(xué)特性及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的系統(tǒng)研究還鮮有報道。

如今，隨著廣西番茄的規(guī)?；a(chǎn)以及已形成相對固定的生產(chǎn)區(qū)域，番茄連作障礙現(xiàn)象已逐年嚴重。目前廣西番茄的主要產(chǎn)區(qū)之一田陽縣，其農(nóng)資市場就充斥著各種防治連作障礙的農(nóng)藥廣告。經(jīng)筆者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些農(nóng)藥均以化學(xué)農(nóng)藥為主。考慮到長期大量使用單一的化學(xué)農(nóng)藥將不可避免地導(dǎo)致病原菌抗藥性的增強以及農(nóng)藥殘留等引發(fā)二次污染問題，本文針對目前廣西番茄生產(chǎn)實踐中存在的實際問題，擬利用生物技術(shù)克服番茄的連作障礙，保障廣西番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但至今仍對番茄連作土壤的生態(tài)系統(tǒng)及肥力變化缺乏系統(tǒng)地了解。

為此，本文利用基于培養(yǎng)及非培養(yǎng)的傳統(tǒng)和現(xiàn)代分析技術(shù)，分別對番茄連作、輪作土壤的生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)展開了分析，旨在揭示連作與輪作土壤中生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為解決廣西乃至于全國番茄產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的連作障礙問題以及構(gòu)建番茄可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)體系提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1供試材料與試驗處理

于2010年3月至2012年6月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地采用露地栽培方式進行試驗。小區(qū)面積約為2 m×24 m，3次重復(fù)，常規(guī)管理方式種植。番茄采用育苗后移栽的方式進行。試驗土壤為赤紅土，土壤pH 6.78，有機質(zhì)含量20.03 g·kg-1，全氮2.14 g·kg-1，全鉀23.42 g·kg-1，速效氮182.19 mg·kg-1，全磷1.21 g·kg-1，速效磷60.34 mg·kg-1，速效鉀248.25 mg·kg-1。試驗共6個處理，如表1所示，隨機區(qū)組排列，每個處理為1個小區(qū)。1年2茬，每個處理3次重復(fù)。

表1　番茄連作與輪作處理Table 1　Rotation and Continuous Cropping Treatments of Tomatoes

1.2土壤采集和測定

2012年6月時采集土壤樣品，每個處理小區(qū)多點隨機采集0～30 cm耕作層土壤，以小區(qū)為單位將土樣混勻后一部分過2 mm篩后置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物學(xué)性狀及細菌群落結(jié)構(gòu)的分析；另一部分室內(nèi)自然風(fēng)干后過0.5 mm篩用于土壤理化性狀的分析。

土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定采用稀釋平板法（林先貴，2010）進行。其中，細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，每個操作5次重復(fù)。

微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸提取法（Joergensen et al.，1990；Vance et al.，1987）測定。

β-葡糖苷酶（β-Glucosidase）活性采用Hayano法（1973）測定。

蛋白酶（protease）活性采用Ladd法（1972）測定。

磷酸酶（phosphatase）活性采用Tabatabai et al.（1969）的方法測定。

土壤細菌群落結(jié)構(gòu)：土壤基因組總DNA的提取參照Krsek et al.（1999）的方法稍加改良。即：稱取5 g土壤，采用提取液和回收試劑盒（Biospin gel extraction kit，Bioflux，產(chǎn)品號：bsc02m1）進行基因組總DNA的提取和純化，粗提和純化結(jié)果采用1.0%（V/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測；純化后樣品于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

土壤細菌16S rDNA V3可變區(qū)的PCR擴增：采用對大多數(shù)細菌的16S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對F338GC和R518（劉瑋等，2010；Erik et al.，1999），上游引物序列為F338GC5'-(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3')；下游引物為R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')，PCR產(chǎn)物用1.5% （V/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測。

變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析：采用Bio-Rad公司DCodeTM基因突變檢測系統(tǒng)（DCode Universal Mutation Detection System，BIO-RAD）對PCR反應(yīng)產(chǎn)物分離。樣品在變性劑濃度30%～60%的8%聚丙烯酰胺凝膠中，100 V的恒定電壓下，60 ℃電泳7 h。電泳完畢后，凝膠銀染20～30 min后用GelDoc凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽百奧科技有限公司）觀察并拍照。

細菌16S rDNA片段的克隆和測序：切下目的條帶，用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收，以不含GC片段的引物對F338 （5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和R518再次進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中檢測，由上海生物生工有限公司進行克隆和測序。

DGGE圖譜：采用Quantity one（V4.6.9）分析軟件（Bio-Rad）對各土壤樣品的電泳條帶數(shù)及密度進行定量分析。多樣性指數(shù)（H）、豐度（S）和均勻度（EH）的計算方法參照羅海峰等（2003）的方法進行。

測序所得結(jié)果用NCBI的Blast程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列同源性分析，采用Sequence match程序（http://rdp.cme.msu.edu/Ribosomal Database Project Ⅱ-Release9 website）進行細菌分析。

1.3統(tǒng)計分析方法

本試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2　結(jié)果與分析

2.1可培養(yǎng)微生物的數(shù)量

土壤微生物三大類群（細菌、真菌和放線菌）是構(gòu)成土壤微生物的主要生物量，它們的類群組成和數(shù)量變化通常能反映土壤的生物活性水平，顯示土壤中物質(zhì)代謝的旺盛程度，亦是反映土壤肥力的一個重要指標(biāo)（朱海平等，2003）。

由表2可知，可培養(yǎng)細菌數(shù)量在長期番茄連作土壤中最少，而在輪作豆科菜豆的土壤中最多，數(shù)量表現(xiàn)依次為處理6＞處理5＞處理4＞處理2＞處理3＞處理1土壤?？膳囵B(yǎng)細菌數(shù)量在輪作和連作土壤中的差異均達極顯著水平。同時，可培養(yǎng)放線菌數(shù)量在番茄輪作和連作土壤中呈現(xiàn)出與可培養(yǎng)細菌類似的變化趨勢。然而，可培養(yǎng)真菌數(shù)量卻呈現(xiàn)出與土壤可培養(yǎng)細菌相反的變化趨勢，即：處理1＞處理2＞處理3＞處理5＞處理4＞處理6土壤，而且可培養(yǎng)真菌數(shù)量在番茄連作和輪作土壤中的差異均達顯著差異水平。此外，輪作不同蔬菜作物處理間，可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量均以輪作菜豆為最大，可培養(yǎng)真菌數(shù)量則以輪作菜豆為最小。以上結(jié)果表明：番茄連作不僅導(dǎo)致土壤中可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量顯著降低，而且可導(dǎo)致土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量顯著增加。同時，黃瓜、白菜和菜豆3種輪作蔬菜作物中，以輪作菜豆對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響效果最為顯著。

表2　番茄連作對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Table 2　Effect of continuous cropping on soil microbial numbers in tomato field

2.2番茄連作對土壤微生物生物量碳、氮的影響

土壤微生物生物量碳和氮（Microbial Biomass C and N，分別縮寫為MBC和MBN，下同）是植物礦質(zhì)養(yǎng)分的源和匯，微生物生物量越大，土壤保肥作用越強，并使土壤養(yǎng)分趨于積累（Carter et al.，1984）。由表3可知，MBC和MBN在不同耕作處理土壤中的變化趨勢均表現(xiàn)出輪作大于連作土壤。其中，MBC大小表現(xiàn)為處理6＞處理5＞處理4＞處理2＞處理3＞處理1；而MBN表現(xiàn)為處理6＞處理5＞處理4＞處理1＞處理3＞處理2。兩者間的差異僅表現(xiàn)在連作處理間的大小順序。雖然MBC和MBN在輪作不同蔬菜作物處理間不一定存在顯著性差異，但在輪作和連作處理間幾乎都存在著顯著性差異，僅MBC在輪作處理4與連作處理2之間不存在顯著性差異。無論是MBC或MBN，輪作不同蔬菜作物處理間均表現(xiàn)為以輪作豆科的菜豆為最大。

表3　番茄連作對土壤微生物生物量碳和氮的影響Table 3　Effect of continuous cropping on soil biomass C and N in tomato fields

總之，微生物生物量碳、氮在番茄連作土壤中均顯著低于輪作土壤，而且在輪作葫蘆科（黃瓜）、十字花科（白菜）和豆科（菜豆）蔬菜作物中，以輪作豆科菜豆的提升效果最為顯著。

2.3番茄連作對土壤涉及碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性的影響

β-葡糖苷酶是表征土壤碳素循環(huán)速度的重要指標(biāo)之一。番茄連作土壤中β-葡糖苷酶活性均極顯著低于輪作土壤，各耕作處理方式土壤中β-葡糖苷酶活性大小順序依次為處理6＞處理5＞處理4＞處理1＞處理3＞處理2（圖1）。這一現(xiàn)象表明：與輪作土壤相比，番茄連作土壤中涉及碳素循環(huán)的轉(zhuǎn)化速度減緩，其原因可能與連作土壤的微生物數(shù)量下降有關(guān)（表1）。

圖1　番茄輪作和連作土壤酶活性變化比較Fig.1　Comparison in soil enzyme activities between the rotation and continuous cropping fields

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶，其活性高低直接影響著土壤的有機磷分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性。土壤磷酸酶包括酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶（和文祥等，2003）。本試驗供試土壤pH在7.0以下，所以僅測定其中的酸性磷酸酶。從圖1可以看出，除輪作黃瓜處理外，番茄連作土壤中的磷酸酶活性均極顯著低于輪作土壤。其中，輪作土壤中以輪作菜豆的土壤中磷酸酶活性為最高，其次分別為白菜和黃瓜。這一現(xiàn)象表明：番茄連作可導(dǎo)致土壤中有機磷的礦化以及生物有效性降低。

蛋白酶參與土壤中蛋白質(zhì)以及其他含氮有機化合物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其水解產(chǎn)物是植物吸收氮的來源之一（關(guān)松蔭，1986）。蛋白酶活性受植物根系分泌物、微生物種類和群落結(jié)構(gòu)以及土壤特性等因素的影響（楊萬勤等，2002）。同樣地，番茄連作土壤中蛋白酶活性均低于輪作土壤。同時，蛋白酶活性以輪作菜豆土壤為最高，其次分別為輪作白菜和黃瓜土壤，而且除輪作黃瓜處理外，番茄連作和輪作土壤之間的蛋白酶活性呈極顯著差異（圖1）。上述涉及土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性的結(jié)果表明：輪作制度不僅有利于提高土壤酶的活性，而且3種輪作蔬菜作物中，同樣以輪作菜豆處理對提高土壤酶活性的效果最佳。

2.4番茄連作對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1基因組DNA提取和PCR擴增

分別對番茄連作和輪作的土壤樣品提取微生物總DNA，并取4 μL DNA樣用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖2可以看出，試驗提取的總DNA亮度較好，而且無明顯拖帶現(xiàn)象。此外，在核酸蛋白測定儀上測定OD260和OD280的值，OD260/OD280值介于1.8和2.0之間，說明所得到的總DNA質(zhì)量符合實驗要求（徐曉宇等，2005）。

圖2　番茄連作和輪作土壤總DNA的瓊脂糖電泳圖譜Fig.2　Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from the soils collected from the rotation and continuous cropping tomatoes fields

以提取的土壤微生物總DNA為模板，F(xiàn)338-GC 和R518為擴增引物，對16S rDNA V3可變區(qū)進行PCR擴增。如圖3所示，16S rDNA擴增后的DNA片段長度為250 bp左右，特異性好、無雜帶，與理論值相符。說明該PCR程序適用于16S rDNA的擴增，并且能夠得到較好的產(chǎn)物。

圖3　番茄連作和輪作土壤細菌16SrDNA基因V3區(qū)擴增片段圖譜Fig.3　PCR amplified fragment 16S rDNA (V3) gene of the soil bacteria collected from the rotation and continuous cropping tomatoes fields

2.4.2土壤細菌群落DGGE圖譜分析

應(yīng)用DGGE技術(shù)分離16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物，可分離到數(shù)目不等、位置各異的電泳條帶（圖4）。根據(jù)DGGE的分析原理，每一個條帶大致與群落中的一個優(yōu)勢菌群或操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）相對應(yīng)，條帶數(shù)越多，說明生物多樣性越豐富；條帶染色后的熒光強度越亮，表示該種屬的數(shù)量越多。由此反映土壤中的微生物種類和數(shù)量（Krsek et al.，1999）。比較不同耕作制度條件下土壤細菌16S rDNA V3區(qū)片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜（圖4a）及其示意圖（圖4b）發(fā)現(xiàn)：各不同處理條件下土壤細菌DGGE圖譜的條帶數(shù)量為：處理6（S為13）＞處理4（S 為10）＞處理5（S為8）＞處理3（S為7）＞處理1（S為6）＞處理2（S為5）。這一結(jié)果表明：同科作物（番茄、茄子和辣椒）連作導(dǎo)致土壤細菌豐富度下降，而輪作不同科屬作物（葫蘆科、十字花科和豆科）可提高土壤中細菌的豐富度。其中，輪作3種不同蔬菜作物土壤中細菌豐富度以輪作菜豆為最高，其次分別為輪作黃瓜和白菜土壤。

此外，根據(jù)細菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中條帶的位置和亮度的數(shù)值化結(jié)果計算了細菌的多樣性（Shannon-Wiener）指數(shù)，Shannon-Wiener指數(shù)值越大，表明細菌群落多樣性越高（吳展才等，2005）。由表4可知：不同耕作制度條件下土壤細菌多樣性指數(shù)的大小順序為：處理6（2.40）＞處理4（2.02）＞處理5（1.70）＞處理3（1.64）＞處理2 （1.36）＞處理1（1.22）。這些結(jié)果說明：同科作物連作土壤細菌多樣性遜于輪作土壤的同時，3種輪作蔬菜作物中，亦以輪作菜豆土壤的細菌多樣性指數(shù)為最高。

均勻度表示物種在環(huán)境中的分布狀況，各物種數(shù)目越接近，數(shù)值越高（陳法霖等，2011）。由表4可知：番茄連作和輪作土壤中細菌均勻度指數(shù)以輪作高于連作，而且3種蔬菜作物輪作土壤中仍以輪作菜豆的為最高。

表4　番茄不同連作與輪作土樣16SrDNA 細菌群落多樣性比較Table 4　Comparison soil bacterial community structure between the rotation and continuous cropping tomatoes fields

2.4.3細菌16S rDNA片段的序列分析

在DGGE分離后的條帶中，隨機選取其中10條熒光強度較亮的主條帶進行切膠回收、重新PCR擴增和測序，其中有8條獲得測序結(jié)果（圖4a）。將這8個序列提交NCBIGenbank數(shù)據(jù)庫中用Blast進行檢索和同源性比較，結(jié)果如表5所示。其中，條帶A是連作土壤中的特征條帶，條帶B、D、E、F和G是番茄連作和輪作土壤中的共有條帶，而條帶C和H是輪作土壤的特征條帶。一般認為16 SrDNA序列同源性小于98%，可以認為屬于不同種的細菌，如果同源性小于93%～95%，則可以認為屬于不同的屬（趙興青等，2006）。另外，分離土壤樣品所獲條帶序列長度僅介于199～206 bp之間。由于堿基數(shù)太少，一般只能鑒定到屬而尚未能鑒定到種（劉新春等，2005）。

圖4　番茄連坐與輪作土壤細菌DGGE圖譜及示意圖Fig.4　DGGE profile (a) and sketch map (b) of the soil bacteria collected from the rotation and continuous cropping tomatoes fields

從表5可知，除條帶C和條帶E所代表的菌株與數(shù)據(jù)庫中的假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）和埃希氏桿菌屬（Escherichia sp.）同源性超過99%，可以認為是同一種，屬于假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）和埃希氏桿菌屬（Escherichia sp.）外，其余6個條帶所屬菌株與數(shù)據(jù)庫中目前未獲得純培養(yǎng)的不可培養(yǎng)菌株之間存在著97%～99%的相似性。上述結(jié)果表明：番茄連作導(dǎo)致土壤細菌的優(yōu)勢種群發(fā)生變化；番茄連作土壤中主要以不可培養(yǎng)細菌（Uncultured bacterium）為優(yōu)勢種屬，而輪作土壤中除了存在不可培養(yǎng)細菌屬之外，還出現(xiàn)假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）等促生細菌種屬。

表5　DGGE優(yōu)勢條帶的基因片段序列的比對結(jié)果Table 5　Comparison of genomic sequences in dominant DGGE bands by sequencing and BLAST analysis

3　討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)之一，其活性和群落結(jié)構(gòu)變化能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況（鐘文輝等，2004）。如今，土壤微生物指標(biāo)已被公認為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)（任天志等，2000）。其中，土壤細菌占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤中最活躍的因素（曹志平，2007)。因此分析番茄連作土壤的生物學(xué)指標(biāo)和細菌群落結(jié)構(gòu)變化或許有助于發(fā)現(xiàn)和找到克服番茄連作障礙的方法。

土壤微生物數(shù)量受土壤養(yǎng)分含量、作物類型以及感病與否等理化及生態(tài)因素影響，其中與作物感病與否的關(guān)系尤為密切（楊尚東等，2013）。本文分析結(jié)果顯示：與輪作土壤相比，番茄連作導(dǎo)致土壤可培養(yǎng)細菌、放線菌數(shù)量顯著降低，真菌數(shù)量顯著增加。這與許多前人的研究結(jié)果（Li et al，2012；周寶利等，2010；杜茜等，2012）相一致。同時這一現(xiàn)象亦表明：番茄連作土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，使土壤由細菌型土壤向真菌型轉(zhuǎn)變，土壤生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)可能是番茄連作土壤容易發(fā)生連作障礙的主要原因。

土壤酶主要來源于土壤微生物和根系分泌物。土壤中有機質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，主要依賴于微生物所產(chǎn)生的酶具有的催化活性來推動。連作對土壤酶活性的影響根據(jù)不同作物和連作年限而得到的結(jié)論不一致。例如：賀麗娜等（2008）發(fā)現(xiàn)黃瓜連作土壤堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)升高或下降的趨勢，而劉建國等（2009）發(fā)現(xiàn)隨著棉花連作年限增加，土壤中性磷酸酶活性呈先下降后升高的趨勢。但本文的分析結(jié)果顯示，無論是涉及碳素循環(huán)的β-葡糖苷酶還是涉及土壤磷循環(huán)的磷酸酶亦或是涉及氮循環(huán)的蛋白酶活性，其在輪作土壤中的活性均呈現(xiàn)高于連作土壤的趨勢。本文的分析結(jié)果雖然與劉建國等（2009）在棉花上的分析結(jié)果不一致，但與黃瓜的分析結(jié)果相類似，其原因可能是不同作物基于不同生長期而對土壤環(huán)境變化的響應(yīng)不同所致。另外，這一現(xiàn)象亦說明番茄連作土壤中涉及碳、氮、磷循環(huán)的生物活動作用強度不僅低于輪作土壤，而且也預(yù)示著番茄連作土壤中的有機質(zhì)轉(zhuǎn)化以及速效養(yǎng)分的形成遜于輪作土壤，并可能導(dǎo)致作物生長過程中可利用的養(yǎng)分不足，使作物長勢弱、抗性變差，出現(xiàn)連作障礙。

土壤微生物生物量是衡量土壤質(zhì)量、維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力的一個重要指標(biāo)（Powlson et al.，1987）。番茄連作和輪作土壤中微生物生物量碳、氮指標(biāo)均以輪作土壤高于連作土壤，原因是番茄輪作后，土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，微生物數(shù)量增加、酶活性提高，加速了土壤中有機質(zhì)的分解，為微生物生長提供了更為充足的營養(yǎng)成分。同時，肖新等（2015）人亦發(fā)現(xiàn)輪作方式可顯著提高滁菊連作土壤中的微生物生物量碳、氮，這一結(jié)果與本文的分析結(jié)果相一致。由此可以推斷：番茄連作導(dǎo)致土壤肥力下降，而輪作則有助于提高土壤肥力，而且3種輪作蔬菜作物中，以輪作菜豆最有利于提高土壤肥力。

土壤微生物是表征土壤環(huán)境質(zhì)量的主要指標(biāo)之一（曹志平，2007)。本文對番茄連作和輪作土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，土壤細菌多樣性指數(shù)（H）、豐富度（S）以及均勻度指數(shù)（EH）均以輪作土壤高于連作土壤。這一結(jié)果與吳鳳芝等（2007）的研究結(jié)果相一致。此外，測序結(jié)果還表明：番茄連作土壤中主要以不可培養(yǎng)細菌（Uncultured bacterium）為優(yōu)勢種屬，而輪作土壤中除了存在不可培養(yǎng)細菌屬之外，還出現(xiàn)假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）等促生細菌種屬。本文的分析結(jié)果與岳冰冰（2012）在烤煙連作土壤的研究結(jié)果相類似。此外，這一結(jié)果亦證實了番茄連作容易發(fā)生連作障礙的根本原因，即：連作導(dǎo)致表征土壤肥力的生物學(xué)性狀劣化的同時，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)亦發(fā)生顯著變化，多樣性下降，導(dǎo)致連作土壤中較為單一的微生物群落結(jié)構(gòu)對病原菌的拮抗能力下降。同時，連作還導(dǎo)致土壤中速效養(yǎng)分含量降低，使得缺乏養(yǎng)分的作物長勢偏弱，抗性降低從而容易被土壤中累積的病原菌所侵染而發(fā)生連作障礙。同時，輪作不僅有助于提高表征土壤肥力的生物學(xué)性狀，而且有助于保持相對穩(wěn)定的微生物物群落結(jié)構(gòu)和更為豐富的細菌多樣性，亦有助于提高番茄對病原微生物的拮抗能力，降低了作物罹患土傳病害的風(fēng)險，有效地避免了連作障礙的發(fā)生。

4　結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，一方面番茄連作不僅導(dǎo)致土壤微生物群落由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，而且導(dǎo)致指示土壤肥力和健康的生物學(xué)指標(biāo)下降。同時，番茄連作還導(dǎo)致土壤細菌多樣性指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（EH）和豐富度指數(shù)（S）下降，菌群失衡；另一方面，番茄輪作不僅有利于提高土壤肥力，而且有助于保持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。此外，番茄輪作黃瓜、白菜和菜豆3種不同科屬蔬菜作物中，以輪作菜豆更有利于提高土壤肥力和保持土壤健康。

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Comparison of Soil Microbial Properties and Bacterial Community Structure in Continuous Cropping and Rotation Fields of Tomatoes

YANG Shangdong1,2,LI Rongtan1,WU Jun1,GUO YiJuan1,LONG Minghua1

1.Agricultural College,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab//Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China

Abstract:At present,with the development of tomato industry and regularization of produce in China,continuous cropping obstacle problem of tomato is more severe.To ensure the implementation of sustainable development of tomato industry,this paper presents a detail analysis of the changes of soil biological properties and bacterial community structure between continuous and rotation cropping of tomatoes.In this experiment,the continuous and rotation cropping models,such as tomato-tomato,tomato-eggplant,tomato-pepper,tomato-cucumber,tomato-Chines cabbage,tomato-kidney beans were randomly divided into 6 disposals,with 3 repetitions in each disposal.Using the traditional and modern analyzing techniques,such as dilution-plate method and PCR-DGGE,etc.,the soil microbial properties and bacterial community structure in soils between rotation and continuous cropping fields of tomatoes were analyzed.Results showed that the numbers of cultivable bacteria and actinomycetes in the continuous cropping soil were significantly decreased compare to those in rotation fields and the numbers of cultivable fungi were significantly increased.Moreover,the activities of soil enzymes that are involved in C,N and P recycling (β-Glucosidase,phosphatase and protease) and biomass C,N in the continuous cropping soil were significantly lower than those in rotation fields.Additionally,in terms of bacterial diversity index,both the richness/evenness in the continuous cropping fields was inferior to the rotation soils,respectively.Meanwhile,in the tomato continuous cropping field,the uncultured bacterium was the dominant species.By contrast,except of the higher bacterial diversity,richness and evenness indexes,some of the plant growth promoting bacteria (PGPB),such as Pseudomonas,etc.,was also detected in the rotation fields.All the findings indicate that rotation cultivation is more helpful for improving soil fertility and maintaining soil health.Finally,kidney bean was the best rotation crop for tomatoes among the three rotation crops such as cucumbers,Chinese cabbage and kidney beans.

Key words:tomato; continuous cropping; bacterial community structure; biological properties; PCR-DGGE

收稿日期：2015-11-06

作者簡介：楊尚東（1970年生），男，副教授，博士，專業(yè)方向為園藝植物營養(yǎng)與環(huán)境調(diào)控、土壤生態(tài)學(xué)。E-mail:ysd706@gxu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31360506）；廣西南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（20132313）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西大宗蔬菜創(chuàng)新團隊專項（nycytxgxcxtd-03-10-1）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室開放課題（12-K-05-02）

中圖分類號：S314; X171.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）01-0076-08

DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.01.011

引用格式：楊尚東,李榮坦,吳俊,郭伊娟,龍明華.番茄連作與輪作土壤生物學(xué)特性及細菌群落結(jié)構(gòu)的比較[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2016,25(1):76-83.