慢性高原病患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖及凋亡變化

馮婷婷，冀林華，劉芳，韓園芳，任榮，胡一博，李建平，熊華，尹啟超，崔森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧810001)

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慢性高原病患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖及凋亡變化

馮婷婷，冀林華，劉芳，韓園芳，任榮，胡一博，李建平，熊華，尹啟超，崔森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧810001)

目的 觀察慢性高原病(CMS)患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖、凋亡變化。方法 提取16例CMS患者(CMS組)及16例單純陳舊性骨折患者(對(duì)照組)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)，用免疫磁珠法分選CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞。用CCK-8法檢測(cè)骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖能力，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率，集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)算骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞及BMMNCs克隆形成率。結(jié)果 與對(duì)照組比較，CMS組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖能力升高，凋亡率降低(P均<0.05)。培養(yǎng)第7、14天，兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞克隆形成率比較，P均>0.05；兩組BMMNCs克隆形成率比較，P均<0.05。結(jié)論 CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖增加、凋亡減少。

高原病，慢性；CD71+有核紅細(xì)胞；CD235a+有核紅細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

慢性高原病(CMS)是高原常見疾病。在海拔2 500 m以上地區(qū)，機(jī)體進(jìn)行自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)高原環(huán)境。但CMS是機(jī)體對(duì)高原低氧環(huán)境代償功能失調(diào)而引起紅細(xì)胞的過(guò)度積累，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體損害。目前有關(guān)CMS患者紅細(xì)胞增殖與凋亡失衡的報(bào)道較少。2014年3月～2015年10月，本研究對(duì)16例CMS患者骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞的增殖與凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步了解紅細(xì)胞過(guò)度積累的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本院收治的CMS患者16例(CMS組)，符合第六屆國(guó)際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會(huì)的CMS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。均為漢族男性，年齡(46.43±7.1)歲；血紅蛋白(Hb)(224.87±10.6)g/L，動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)(82.28±9.8)%，血細(xì)胞比容(Hct)(66.94±3.8)%。單純陳舊性骨折患者16例作為對(duì)照組，均為漢族男性，年齡(43.61±6.1)歲；Hb(145.50±10.1)g/L，SaO2(97.26±8.7)%，Hct為(44.51±3.1)%；血象及骨髓象均正常，與健康人骨髓涂片無(wú)差別。兩組居住海拔均為2 500～4 000 m；均排除感染、惡性腫瘤及其他系統(tǒng)系疾病。兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究獲得青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意?；颊咧橥?。

1.2 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞分選 CMS組與對(duì)照組均于髂后上棘處采集骨髓液10 mL，肝素抗凝。采用密度梯度離心法提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)，將分離好的BMMNCs制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)加入CD71抗體10～20 μL，4 ℃孵育15 min后進(jìn)行磁珠分選，取CD71+細(xì)胞，剩余CD71-細(xì)胞。磁珠buffer重懸CD71-細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)加入CD235a抗體，4 ℃孵育15 min后進(jìn)行磁珠分選，取CD235a+細(xì)胞，將分選后的CD71+、CD235a+細(xì)胞混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。磁珠分選后以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞純度分析，單次分選后純度均在85%以上。

1.3 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。取分選好的CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2、3% O2、飽和濕度三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；加CCK-8 10 μL孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)作為骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值。

1.4 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞凋亡率測(cè)定 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)。取分選好CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞(1×106)，PBS洗滌2次，重懸后移入流式管，加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL避光反應(yīng)15 min后上機(jī)檢測(cè)，采集10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。Annexin V+PI-細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+PI+細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，以二者總和計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞、BMMNCs克隆形成率測(cè)算 采用集落形成實(shí)驗(yàn)。選取分選好的CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞接種于含有0.9%甲基纖維素、30% FBS、4 mol/L 2-巰基乙醇及1%雙抗的IMDM培養(yǎng)體系中，加入重組人促紅細(xì)胞生成素(EPO)3 IU、重組人白細(xì)胞介素3 20 ng，接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞為1×104/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)復(fù)孔。孔板周圍加PBS，保持濕度。于37 ℃、5%CO2、3%O2、飽和濕度三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第7、14天觀察并計(jì)算克隆形成率。BMMNCs接種、培養(yǎng)同上，調(diào)整細(xì)胞為1×105/孔，培養(yǎng)第7天觀察紅細(xì)胞集落生成單位(CFU-E)數(shù)量，計(jì)算克隆形成率；培養(yǎng)第14天觀察CFU-E及紅細(xì)胞爆裂型集落生成單位(BFU-E)數(shù)量，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞增殖比較 CMS組、對(duì)照組OD值分別為1.037±0.276、0.499±0.158，兩組比較，P<0.05。

2.2 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞凋亡率比較 CMS組、對(duì)照組CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞凋亡率分別為(5.00±2.76)%、(14.25±11.76)%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組骨髓CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞克隆形成率比較 培養(yǎng)第7天 CMS組、對(duì)照組克隆形成率分別為(7.82±4.93)%、(4.88±3.57)%，兩組比較，P>0.05。培養(yǎng)第14天，CMS組、對(duì)照組克隆形成率分別為(8.93±6.47)%、(6.67±3.50)%，兩組比較，P>0.05。

2.4 兩組BMMNCs克隆形成率比較 培養(yǎng)第7天，CMS組、對(duì)照組BMMNCs克隆形成率分別為(19.02±1.95)%、(15.89±4.34)%，兩組比較，P<0.05。培養(yǎng)第14天，CMS組、對(duì)照組BMMNCs CFU-E克隆形成率分別為(22.89±3.81)%、(17.89±3.18)%，兩組比較，P<0.05；CMS組、對(duì)照組BMMNCs BFU-E克隆形成率分別為(2.42±0.70)%、(1.96±0.53)%，兩組比較，P<0.05。

3 討論

CMS是近年研究的熱點(diǎn)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究取得較大進(jìn)展。細(xì)胞增殖、信號(hào)途徑、造血調(diào)控因子[2]、微血管密度、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、其他細(xì)胞調(diào)控因子[3～6]及細(xì)胞凋亡[7]等均對(duì)CMS的發(fā)病有一定影響。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能通過(guò)提高缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)及HIF-2α水平促使機(jī)體產(chǎn)生EPO和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，而EPO和VEGF可促進(jìn)紅細(xì)胞生成[8]。另有研究表明，CMS的發(fā)生亦與基因有關(guān)，兒童時(shí)期HIF-1α及HIF-2α基因表達(dá)高的個(gè)體，成年后在高海拔地區(qū)易發(fā)生CMS[9]。同時(shí)CMS患者亦會(huì)表現(xiàn)為輕度睡眠呼吸暫停和氧化應(yīng)激[10]，從而加重患者的缺氧狀態(tài)。CD71在紅系前體細(xì)胞階段表達(dá)較高，隨著紅系發(fā)育成熟，表達(dá)逐漸降低[11]；而CD235a表達(dá)與CD71的表達(dá)相反，隨著紅系發(fā)育成熟其表達(dá)逐漸升高[12]。CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞可作為骨髓有核紅細(xì)胞群體的代表。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CMS組細(xì)胞凋亡率降低，CMS組BMMNCs凋亡減少，細(xì)胞增殖比例增加，有核紅細(xì)胞產(chǎn)生累積效應(yīng)。蔡玉亮等[7]研究表明，CMS的主要發(fā)病機(jī)制與BMMNCs凋亡減少、增殖增加有關(guān)；血紅蛋白與BMMNCs增殖并無(wú)明顯相關(guān)性。與本研究結(jié)果相符。

CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞屬于造血干細(xì)胞所分化出來(lái)的有核紅細(xì)胞，到成熟細(xì)胞分裂次數(shù)僅為3～5次，不易形成集落，僅形成集簇。進(jìn)行集簇計(jì)數(shù)，在第7、14天時(shí)兩者并無(wú)明顯差異。采用BMMNCs進(jìn)行集落培養(yǎng)，第7天時(shí)CFU-E、第14天時(shí)CFU-E及BFU-E克隆形成率，與對(duì)照組相比均明顯增高。說(shuō)明CMS組有核紅細(xì)胞增殖能力增高。低氧環(huán)境可能活化了紅細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]，由于信號(hào)通路的作用而導(dǎo)致有核紅細(xì)胞生成增加。本研究中細(xì)胞培養(yǎng)第7、14天時(shí)兩組有核紅細(xì)胞克隆形成率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與有核紅細(xì)胞成熟有關(guān)。在觀察時(shí)部分有核紅細(xì)胞已經(jīng)成熟，形成成熟紅細(xì)胞，無(wú)法觀察集簇的形成。紅細(xì)胞生成信號(hào)通路是個(gè)復(fù)雜的通路[14]，CMS組在長(zhǎng)期缺氧的環(huán)境中可能導(dǎo)致數(shù)條信號(hào)通路增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞累積。提示CMS組增殖能力高于對(duì)照組。CD71+、CD235a+有核紅細(xì)胞凋亡減少，亦可能與紅細(xì)胞信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)有關(guān)。

因此，CMS發(fā)生機(jī)制可能與有核紅細(xì)胞的增殖與凋亡失衡有關(guān)，未來(lái)可進(jìn)一步深入研究紅細(xì)胞信號(hào)通路，對(duì)紅細(xì)胞信號(hào)通路與CMS的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步探究。

[1] León-Velarde F, Maggiorini M, Reeves JT, et al. Consensus statement on chronic and subacute high altitude diseases[J]. High Alt Med Biol, 2005,6(2):147-157.

[2] 顏金花,李占全,冀林華,等.慢性高原病血清血管生成因子的變化[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2009，25(4):457-460.

[3] 冀林華,李占全,崔森,等.JAK2基因V617F點(diǎn)突變?cè)诟咴t細(xì)胞增多癥患者中的臨床意義研究[J].中華血液學(xué)雜志,2012,33(4):319-320.

[4] 蘇娟,賈乃鏞,李占全,等.高原紅細(xì)胞增多癥患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞磷酸化STAT5和p38-MAPK水平研究[J].中華血液學(xué)雜志,2008,29(12):836-837.

[5] 李建平,賈乃鏞,李占全,等.高原紅細(xì)胞增多癥患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞GATA-1和GATA-2的表達(dá)研究[J].中華血液學(xué)雜志,2007,28(8):537-540.

[6] 鄒成林,崔森,冀林華,等.慢性高原病骨髓細(xì)胞環(huán)氧化酶2和熱休克蛋白70表達(dá)及細(xì)胞凋亡研究[J].廣東醫(yī)學(xué),2010,31(11):1409-1412.

[7] 蔡玉亮,崔森,李占全,等.慢性高原病患者骨髓造血細(xì)胞凋亡及caspase-8和caspase-9表達(dá)研究[J].中華血液學(xué)雜志,2011,32(11):762-765.

[8] Souvenir R, Flores JJ, Ostrowski RP, et al. Erythropoietin inhibits HIF-1α expression via upregulation of PHD-2 transcription and translation in an in-vitro model of hypoxia ischemia[J]. Transl Stroke Res, 2014,5(1):118-127.

[9] Huicho L, Xing G, Qualls C, et al. Abnormal energy regulation in early life: childhood gene expression may predict subsequent chronic mountain sickness[J]. BMC Pediatr, 2008,8(1):47.

[10] Julian CG, Vargas E, Gonzales M, et al. Sleep-disordered breathing and oxidative stress in preclinical chronic mountain sickness (excessive erythrocytosis)[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2013,186(2):188-196.

[11] Dong HY, Wilkes S, Yang H. CD71 is selectively and ubiquitously expressed at high levels in erythroid precursors of all maturation stages: a comparative immunochemical study with glycophorin A and hemoglobin A[J]. Am J Surg Pathol, 2011,35(5):723-732.

[12] Sadahira Y, Kanzaki A, Wada H, et al. Immunohistochemical identification of erythroid precursors in paraffin embedded bone marrow sections: spectrin is a superior marker to glycophorin[J]. J Clin Pathol, 1999,52(12):919-921.

[13] Ingley E. Integrating novel signaling pathways involved in erythropoiesis[J]. IUBMB Life, 2012,64(5):402-410.

[14] 高賽君，葉鐵真.紅細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J].國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志,2009,32(2):145-148.

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2014146)；廣西科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(桂14124004-1-5)。

通信作者：何升(E-mail: 963890708@qq.com)

青海省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2014-HZ-808)。

冀林華(E-mail:13997244508@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.018

R594.3

B

1002-266X(2016)37-0056-03

2016-02-20)