肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗研究進(jìn)展

駱詩(shī)露，黃健，韓道賓，朱杰華，陳澤慧，閔迅

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003)

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肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗研究進(jìn)展

駱詩(shī)露，黃健，韓道賓，朱杰華，陳澤慧，閔迅

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003)

摘要：隨著肺炎鏈球菌(SP)耐藥菌株的不斷出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)備受關(guān)注，但目前使用的莢膜多糖及其結(jié)合疫苗有很大局限性。因此，針對(duì)SP主要毒力因子的蛋白質(zhì)疫苗迅速發(fā)展,其中SP單一蛋白質(zhì)疫苗包括溶血素、表面蛋白A、表面黏附素A、三組氨酸蛋白D、黏附毒力因子A，蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗包括多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗、多價(jià)蛋白質(zhì)融合疫苗，已取得一定實(shí)驗(yàn)和臨床效果，有望替代多糖疫苗。

關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌；重組蛋白；聯(lián)合疫苗；融合疫苗

肺炎鏈球菌(SP)是一種重要的人類(lèi)致病菌，主要引起細(xì)菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病，2歲以下嬰幼兒和60歲以上老年人是其最主要的易感人群。隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，通過(guò)接種疫苗已成為預(yù)防SP感染行之有效的手段。目前，市售的SP疫苗均基于其血清特異性莢膜多糖(CPS)設(shè)計(jì)，主要有多糖疫苗(PPV)、多糖結(jié)合疫苗(PCV)。PPV免疫原性較弱，對(duì)SP主要易感人群的保護(hù)性較差，對(duì)成人SP肺炎以及支氣管炎的作用很弱甚至沒(méi)有作用；PCV雖能有效保護(hù)主要易感人群，但存在覆蓋面窄(僅為歐美國(guó)家的常見(jiàn)血清型)、制備成本較高、使用過(guò)程中存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了其在發(fā)展中國(guó)家的使用。因此，蛋白質(zhì)疫苗已成為近十年SP疫苗的研發(fā)主流。本文就SP單一蛋白質(zhì)疫苗及其聯(lián)合、融合蛋白疫苗的研究進(jìn)展綜述如下。

1SP單一蛋白質(zhì)疫苗

1.1SP溶血素(Ply)Ply是一種膽固醇依賴(lài)的造孔毒素，其具有直接的細(xì)胞毒性作用，能與宿主上皮細(xì)胞表面的膽固醇結(jié)合并插入到脂質(zhì)雙分子層中以形成寡聚孔，能引起細(xì)胞溶解并促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散；此外，Ply還能通過(guò)與C1q、Fc段及CRP結(jié)合以激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，也能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β，從而參與宿主的炎性反應(yīng)。因Ply在低濃度作用時(shí)的促炎效應(yīng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷及細(xì)胞凋亡，所以當(dāng)前運(yùn)用的疫苗主要是經(jīng)過(guò)化學(xué)減毒或無(wú)毒化處理后的衍生物，如第433位苯丙氨酸替換色氨酸的PdB及第146位丙氨酸缺失的ΔA146Ply。Knippenberg等[1]以PdB主動(dòng)免疫小鼠后，可以阻斷Ply介導(dǎo)的肺纖維化效應(yīng)。在構(gòu)建的小鼠鼻黏膜免疫模型中，ΔA146Ply能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，可抵抗不同型別SP引起的致死性感染[2]。此外，PlyD1無(wú)毒衍生物已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期安全性及人體免疫原性試驗(yàn)，證實(shí)成人經(jīng)免疫后能產(chǎn)生大量的抗PlyD1的保護(hù)性抗體[3]。

1.2SP表面蛋白A(PspA)PspA是SP表面的膽堿結(jié)合蛋白，也是一種重要毒力因子。目前，已在其N(xiāo)端和脯氨酸富集區(qū)發(fā)現(xiàn)有B細(xì)胞抗原表位的存在。在小鼠系統(tǒng)性感染模型中，PspA可干擾C3b在SP表面沉積，阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用；并且在小鼠黏膜感染模型中，能夠保護(hù)SP免遭宿主乳鐵蛋白的攻擊[4～6]。此外，Roche等[7]構(gòu)建的Balb/c小鼠敗血癥模型中，經(jīng)皮下或腹腔途徑免疫全長(zhǎng)的PspA，可以顯著提高小鼠的生存時(shí)間及生存率。Arulanandam等[8]構(gòu)建的小鼠鼻咽定植模型證實(shí)，經(jīng)鼻腔滴注全長(zhǎng)的PsaA與IL-12可減少75%的鼻咽部SP定植量。在小鼠中耳炎模型中，PspA抗體同樣能夠提供有效的保護(hù)。

1.3SP表面黏附素A(PsaA)PsaA是一種分子量為37 kD的多功能脂蛋白，其在不同的血清型SP中具有較高的保守性，主要參與SP對(duì)Mn2+、Zn2+的轉(zhuǎn)運(yùn)及對(duì)宿主上皮細(xì)胞的黏附效應(yīng)。有研究證實(shí)，與野生型TIGR4菌株相比，PsaA缺陷菌株能顯著降低其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的黏附能力及其對(duì)CBA/N小鼠的系統(tǒng)性感染能力[9]。PsaA與CT佐劑聯(lián)合經(jīng)鼻咽部免疫小鼠后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生高滴度黏膜抗體IgA；而口服微粒體包裹的PsaA蛋白，血清中可產(chǎn)生高滴度的IgG和IgA抗體，從而抵抗不同血清型SP在肺部定植及敗血癥的形成。Oliveira等[10]將PsaA與乳酸桿菌活菌載體共同經(jīng)鼻腔免疫C57BL/6小鼠后，能夠同時(shí)誘導(dǎo)PsaA特異性的系統(tǒng)免疫抗體IgG和黏膜免疫抗體IgA的產(chǎn)生，從而抑制SP在鼻咽部定植。

1.4SP三組氨酸蛋白D(PhtD)PhtD是Pht家族中最保守的蛋白，能夠介導(dǎo)SP黏附宿主呼吸道上皮細(xì)胞及參與調(diào)節(jié)Zn2+的動(dòng)態(tài)平衡；幫助逃避補(bǔ)體的免疫沉積，激發(fā)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[11，12]。在OF1雌性小鼠鼻咽部致死性攻擊模型中，經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能對(duì)不同血清型SP的致死性攻擊產(chǎn)生很好的保護(hù)效果，且健康人體內(nèi)獲得的抗PhtD血清也能給小鼠敗血癥模型中提供較高的被動(dòng)保護(hù)效果[13]。此外，恒河猴經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能顯著提高其對(duì)19F型SP所致肺炎的抵抗力[14]。針對(duì)PhtD重組蛋白疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)，健康成人免疫接種該蛋白后，能產(chǎn)生很好的體液免疫效果，且未產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)[15]。與傳統(tǒng)的鋁佐劑相比，PhtD與新型佐劑AS02V聯(lián)合使用后，能顯著促進(jìn)PhtD觸發(fā)的體內(nèi)CD4+T細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞的產(chǎn)生，從而提升對(duì)老年人的免疫保護(hù)效果[16]。因此，PhtD成為當(dāng)前單個(gè)疫苗或聯(lián)合疫苗的首選。

1.5SP黏附毒力因子A(PavA)PavA為SP細(xì)胞壁外層的一種纖維連接蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)菌早期黏附及侵襲過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與D39ΔPavA缺陷菌株相比，野生型菌株能逃避人樹(shù)突狀細(xì)胞的吞噬及機(jī)體的固有免疫應(yīng)答[17]。在構(gòu)建的腦膜炎模型中，D39ΔPavA 菌株感染小鼠的毒力明顯下降，且黏附A549、Hep-2細(xì)胞、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的能力也受到了明顯的抑制[18]。

2SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗

目前，尚未見(jiàn)單一SP蛋白質(zhì)疫苗保護(hù)作用強(qiáng)于PPV23的報(bào)道。因此，研究者將不同毒力因子進(jìn)行組合以制備SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗，且蛋白間的共同作用可能起互補(bǔ)效應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，重組PhtD及PspA聯(lián)合疫苗即將啟動(dòng)Ⅱ期臨床。

2.1多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗Briles等[19]將混合后的PspA、PsaA經(jīng)鼻腔免疫小鼠,比二者單獨(dú)免疫更能有效阻止SP在鼻咽部的定植。在19F所致的肺炎模型中，證實(shí)PspA和Ply聯(lián)合免疫能有效抵抗菌血癥甚至是敗血癥[20]。Ogunniyi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與單個(gè)蛋白免疫相比，將PdB、PspA、PspC等兩兩組合，能顯著提高不同血清型SP侵襲性感染小鼠的中位生存率，且3種蛋白聯(lián)合主動(dòng)免疫小鼠能使保護(hù)效果達(dá)到最佳。在近期的臨床對(duì)照研究中，SP膽堿結(jié)合蛋白A (PcpA)+ PhtD+ PlyD1三者聯(lián)合疫苗主動(dòng)免疫不同年齡階段人群，顯示出較高的安全性及免疫原性[22]。但是，也有3種蛋白抗原聯(lián)合的保護(hù)作用不及兩兩聯(lián)合者的報(bào)道，可能為聯(lián)合免疫存在拮抗效應(yīng)所致。因此，仍需繼續(xù)臨床前嘗試，力爭(zhēng)找出最優(yōu)化的多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗。

2.2多價(jià)蛋白質(zhì)融合疫苗融合蛋白是一種將表達(dá)不同蛋白的功能活性域聯(lián)合協(xié)同作用使融合蛋白性能被優(yōu)化,甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)活性的新技術(shù)。Lu等[23]以PsaA-PspA融合蛋白免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量抗PsaA、PspA抗體，該抗體可以與表達(dá)異源PspA的不同血清型SP結(jié)合；在鼻咽部攻擊模型中，與無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)相比，經(jīng)融合蛋白免疫的小鼠可顯著減少其血及肺部定植的細(xì)菌量。融合蛋白PsaA-SP溶血素?zé)o毒衍生物(PdT)與SP細(xì)胞壁肽聚糖混合后經(jīng)鼻腔或皮下免疫小鼠，能引起血清中高滴度抗體和IL-17A的產(chǎn)生，并能在高毒力3型SP攻擊模型中提供保護(hù)[24]。

在Liu等[25]研究中首次證實(shí)了ΔA146Ply具有黏膜佐劑的功能， SP熱休克蛋白(DnaJ)-ΔA146Ply融合蛋白表達(dá)后通過(guò)黏膜途徑能誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG和sIgA，能有效幫助小鼠抵抗SP在鼻咽部、肺部定植及致死性感染。而SP膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)活性肽與 Ply類(lèi)毒素L460D融合后，其保護(hù)效力更為強(qiáng)大，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體除了能夠抵抗SP引起的各種侵襲性疾病(IPD)外，還具有潛在的抵抗其他引起腦膜疾病的病原菌的能力[26]。新近研究顯示，ΔA146Ply基因與 PsaA融合后，能促進(jìn)兒童黏膜免疫系統(tǒng)中Th1/Th17細(xì)胞增殖，有助于抗SP的CD4+T細(xì)胞免疫活性的發(fā)揮。融合蛋白是一種安全有效的新型疫苗，但在融合蛋白的構(gòu)建過(guò)程中難免會(huì)影響或破壞蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)，從而影響其活性的發(fā)揮。因此，在進(jìn)行蛋白融合時(shí)應(yīng)選擇合理的方式，使兩種蛋白質(zhì)的效應(yīng)均得到最大程度發(fā)揮。

目前，PPV和PCV疫苗的保護(hù)效果僅覆蓋部分SP血清型別，且存在血清型替換等諸多問(wèn)題。因此，研發(fā)新型蛋白質(zhì)疫苗迫在眉睫。當(dāng)前，研究者多選擇與SP致病過(guò)程密切相關(guān)的的多價(jià)蛋白質(zhì)聯(lián)合或者蛋白融合疫苗為研究對(duì)象，以觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否具有顯著的保護(hù)效應(yīng)。迄今為止，尚無(wú)FDA批準(zhǔn)的SP蛋白質(zhì)疫苗上市，但隨著相關(guān)研究的不斷深入，多價(jià)SP蛋白質(zhì)疫苗必將造福于人類(lèi)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Knippenberg S, Ueberberg B, Maus R, et al. Streptococcus pneumoniae triggers progression of pulmonary fibrosis through pneumolysin[J]. Thorax, 2015,70(7):636-646.

[2] 姚潤(rùn),崔亞利,袁軍,等.肺炎鏈球菌溶血素ΔA146Ply黏膜免疫的保護(hù)效果[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2011,24(5):579-582.

[3] Kamtchoua T, Bologa M, Hopfer R, et al. Safety and immunogenicity of the pneumococcal pneumolysin derivative PlyD1 in a single-antigen protein vaccine candidate in adults[J]. Vaccine, 2013,31(2): 327-333.

[4] Mukerji R, Mirza S, Roche AM, et al. Pneumococcal surface protein a inhibits complement deposition on thepneumococcal surface by competing with the binding of C-reactive protein to cell-surface phosphocholine[J]. J Immunol, 2012,189(11):5327-5335.

[5] Ren B, Li J, Genschmer K, et al. The absence of pspA or presence of antibody to pspA facilitates the complement-dependent phagocytosis of pneumococci in vitro[J]. Clin Vaccines Immunol, 2012,19(10):1574-1582.

[6] Shaper M, Wilson L, Benjamin WH Jr, et al. Serine protease PrtA from Streptococcus pneumoniae plays a role in the killing of S. pneumoniae by apolactoferrin[J]. Infect Immun, 2011,79(6):2440-2450.

[7] Roche H, Hakansson A, Hollingshead SK, et al. Regions of PspA/EF3296 best able to elicit protection against Streptococcus pneumoniae in a murine infection model[J]. Infect Immun, 2003,71(3):1033-1041.

[8] Arulanandam BP, Lynch JM, Briles DE, et al. Intranasal vaccination with pneumococcal surface protein A and interleukin-12 augments antibody-mediatedopsonization and protective immunity against Streptococcus pneumoniae infection[J]. Infect Immun,2001,69(11):6718-6724.

[9] Johnston JW, Myers LE, Ochs MM, et al. Lipoprotein PsaA in virulence of Streptococcus pneumoniae: surface accessibility and role in protection fromsuperoxide[J]. Infect Immun,2004,72(10):5858-5867.

[10] Oliveira ML, Arêas AP, Campos IB, et al. Induction of systemic and mucosal immune response and decrease in Streptococcus pneumoniae colonization by nas inoculation of mice with recombinant lactic acid bacteria expressing pneumococcal surface antigen A[J]. Mic Infect, 2006,8(4):1016-1024.

[11] Bersch B , Bougault C, Roux L, et al. New insights into histidine triad proteins: solution structure of a streptococcus pneumoniae PhtD domain and zinc transfer to AdcAⅡ[J]. PLoS One, 2013,8(11):81168.

[12] Khan MN, Pichichero ME. CD4 T cell memory and antibody responses directed against the pneumococcal histidine triadproteins PhtD and PhtE following nasopharyngeal colonization and immunization and their role in protection against pneumococcal colonization in mice[J]. Infect Immun, 2013,81(10):3781-3792.

[13] Godfroid F, Hermand P, Verlant V, et al. Preclinical evaluation of the Pht proteins as potential cross-protective pneumococcal vaccine antigens[J]. Infect Immun, 2011,79(1):238-245.

[14] Denoel P, Philipp MT, Doyle L, et al. A protein-based pneumococcal vaccine protects rhesus macaques from pneumonia after experimental infection with Streptococcus pneumoniae[J]. Vaccine, 2011,29(33): 5495-5501.

[15] Seiberling M, Bologa M, Brookes R, et al. Safety and immunogenicity of a pneumococcal histidine triad protein D vaccine candidate in adults[J]. Vaccine, 2012,30(52):7455-7460.

[16] Leroux-Roels I, Devaster JM, Leroux-Roels G, et al. Adjuvant system AS02V enhances humoral and cellular immuneresponses to pneumococcal protein PhtD vaccine in healthy young and older adults: Randomised, controlled trials[J]. Vaccine, 2015,33(4):577-584.

[17] Noske N, K?mmerer U, Rohde M, et al. Pneumococcal interaction with human dendritic cells: phagocytosis, survival, and induced adaptive immune response are manipulated by PavA[J]. J Immunol, 2009,183(3):1952-1963.

[18] Pracht D, Elm C, Gerber J, et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation[J]. Infect Immun, 2005,73(5):2680-2689.

[19] Briles DE, Ades E, Paton JC, et al. Intranasal immunization of mice with a mixture of the pneumococcal proteins PsaA and PspA is highly protective against nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae[J]. Infect Immun, 2000,68(2):796-800.

[20] Briles DE, Hollingshead SK, Paton JC, et al. Immunizations with pneumococcal surface protein A and pneumolysin are protective against pneumonia in a murine model of pulmonary infection with Streptococcus pneumoniae[J]. J Infect Dis, 2003,188(3):339-348.

[21] Ogunniyi AD, Grabowicz M, Briles DE,et al. Development of a vaccine against invasive pneumococcal disease based on combinations of virulence proteins of Streptococcus pneumoniae[J]. Infect Immun, 2007,75(1): 350-357.

[22] Brooks WA, Chang LJ, Sheng X, et al. Safety and immunogenicity of a trivalent recombinant PcpA, PhtD,and PlyD1 pneumococcal protein vaccine in adults, toddlers, and infants: A phase I randomized controlled study[J]. Vaccine, 2015,33(36):4610-4617.

[23] Lu J, Sun T, Wang D, et al. Protective immune responses elicited by fusion protein containing psaA and pspA fragments[J]. Immunol Invest, 2015,44(5):482-496.

[24] Lu YJ, Forte S, Thompson CM, et al. Protection against Pneumococcal colonization and fatal pneumonia by a trivalent conjugate of a fusion protein with the cell wall polysaccharide[J]. Infect Immun, 2009,77(5):2076-2083.

[25] Liu Y, Wang H, Zhang S,et al. Mucosal immunization with recombinant fusion protein DnaJ-ΔA146Ply enhances cross-protective immunity against Streptococcus pneumoniae infection in mice via interleukin 17A[J]. Infect Immun, 2014,82(4):1666-1675.

[26] Mann B, Thornton J, Heath R, et al. Broadly protective protein-based pneumococcal vaccine composed of pneumolysin toxoid-CbpA peptide recombinant fusion protein[J]. J Infect Dis, 2014,209(7):1116-1125.

(收稿日期：2015-11-23)

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)10-0102-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.046

通信作者：閔迅(E-mail: 2815400619@.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460317)；貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7553號(hào))。