二烯丙基二硫?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞miR-200b表達(dá)的影響及意義

羅衛(wèi)民，羅湘玉，郭家龍，林稱意，劉越峰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

二烯丙基二硫?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞miR-200b表達(dá)的影響及意義

羅衛(wèi)民，羅湘玉，郭家龍，林稱意，劉越峰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

目的 探討二烯丙基二硫(DADS)對人非小細(xì)胞肺癌A549(A549細(xì)胞)miR-200b表達(dá)的影響及意義。方法 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞、人支氣管上皮16HBE細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)采用RT-PCR法檢測miR-200b相對表達(dá)量；將A549細(xì)胞分別與終濃度為0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS共培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)采用RT-PCR法檢測miR-200b相對表達(dá)量。將常規(guī)培養(yǎng)的A549細(xì)胞隨機(jī)分為五組，scramble組轉(zhuǎn)染miR-200b無關(guān)序列，miR-200b組轉(zhuǎn)染miR-200b模擬物，空白組僅加培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，DADS組加入200 μmol/L DADS處理，DADS+miR-200b組轉(zhuǎn)染miR-200b 模擬物的同時(shí)加入200 μmol/L DADS處理，各組均連續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況(OD值)。結(jié)果 16HBE細(xì)胞miR-200b相對表達(dá)量為1.364±0.031，高于A549細(xì)胞的0.673±0.023(P<0.05)；0、25、50、100、200、400 μmol/L DADS處理A549細(xì)胞48 h時(shí)miR-200b相對表達(dá)量分別為0.673±0.023、0.752±0.019、0.805±0.011、1.041±0.049、1.176±0.046、1.342±0.051，各濃度間比較P均<0.05。scramble組、miR-200b組、空白組、DADS組、DADS+miR-200b組OD值分別為0.740±0.027、0.552±0.024、0.735±0.021、0.561±0.027、0.462±0.026，miR-200b組、DADS組、DADS+miR-200b組OD值均低于scramble組及空白組，DADS+miR-200b 組均低于DADS組及miR-200b組，組間比較P均<0.05。結(jié)論 DADS能夠上調(diào)A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

非小細(xì)胞肺癌；二烯丙基二硫；miR-200b

二烯丙基二硫(DADS)是從大蒜中提取的天然有機(jī)硫化物，可抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括鼻咽癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等[1～5]，其作用機(jī)制主要為抑制DNA加合物形成，阻滯細(xì)胞周期演進(jìn)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化與凋亡，抑制腫瘤血管形成與侵襲等[6]。研究顯示，miR-200b在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因樣作用[7,8]。但是，miR-200b與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及DADA對其表達(dá)的影響尚不完全明確。2015年3～8月，本研究觀察了DADS對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和人支氣管上皮16HBE細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤研究所惠贈；Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；MTT購于美國Sigma公司；miR-200b模擬物、scramble無關(guān)序列均由Ambion公司設(shè)計(jì)合成；RNA抽提試劑盒購于美國Ambion公司；DADS購于Fluka公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及miR-200b表達(dá)檢測 A549細(xì)胞及16HBE細(xì)胞分別用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細(xì)胞生長至融合80%左右時(shí)，采用RNA抽提試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL、miRNA RT product 2.0 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、滅菌蒸餾水7.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 12 s、62 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-200b相對表達(dá)量。

1.3 DADS對A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)影響的觀察 取1.2常規(guī)培養(yǎng)48 h、生長至融合度80%左右的A549細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，分別將終濃度為0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS加至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用1.2方法檢測miR-200b相對表達(dá)量。

1.4 DADS對A549細(xì)胞增殖影響的觀察 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%左右時(shí)將細(xì)胞隨機(jī)分為五組，scramble組轉(zhuǎn)染scramble(miR-200b無關(guān)序列)，miR-200b組轉(zhuǎn)染miR-200b 模擬物，空白組僅加培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，DADS組加入200 μmol/L(前期將0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS處理A549細(xì)胞48 h，采用MTT法檢測各組吸光度值，并計(jì)算各組細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示，DADS濃度為200 μmol/L組細(xì)胞的抑制率為50%，即DADS的半數(shù)抑制濃度為200 μmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol/L濃度)DADS處理，DADS+miR-200b組轉(zhuǎn)染miR-200b 模擬物的同時(shí)加入200 μmol/L DADS處理。上述五組均在連續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)采用MTT法觀察細(xì)胞增殖情況(測定570 nm波長處吸光度值，即OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1A549細(xì)胞、16HBE細(xì)胞miR-200b表達(dá)比較 常規(guī)培養(yǎng)48h時(shí)16HBE細(xì)胞miR-200b相對表達(dá)量為1.364±0.031，高于A549細(xì)胞的0.673±0.023(P<0.05)。0、25、50、100、200、400μmol/LDADS處理A549細(xì)胞48h時(shí)miR-200b相對表達(dá)量分別為0.673±0.023、0.752±0.019、0.805±0.011、1.041±0.049、1.176±0.046、1.342±0.051，miR-200b相對表達(dá)量呈逐漸增加趨勢(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較scramble組、miR-200b組、空白組、DADS組、DADS+miR-200b組處理48h時(shí)OD值分別為0.740±0.027、0.552±0.024、0.735±0.021、0.561±0.027、0.462±0.026，miR-200b組、DADS組、DADS+miR-200b組OD值均低于scramble組及空白組，DADS+miR-200b組均低于DADS組及miR-200b組，組間比較P均<0.05。

3 討論

手術(shù)切除是肺癌首選的治療方法，但由于缺乏有效的早期診斷方法，約75%的患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會[9]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌的75%～80%[10]，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率約10%[9]。miRNA是一類高度保守，長度為22個(gè)核苷酸的小分子RNA，在真核生物中廣泛表達(dá)。miRNA通過與靶基因mRNA3′UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老等多種生理過程。研究顯示，miR-200b在多種上皮性腫瘤中可以調(diào)控細(xì)胞的周期演進(jìn)與增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及細(xì)胞耐藥等[7]。在宮頸癌細(xì)胞中，miR-200b通過直接下調(diào)RND3表達(dá)，促進(jìn)其下游細(xì)胞周期D1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促使宮頸癌細(xì)胞向S期演進(jìn)[11]。miR-200b通過直接靶向E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，從而抑制EMT[12]。miR-200b通過靶向環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[13]。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-200b通過直接靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Sp1抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)明顯低于16HBE細(xì)胞，提示miR-200b表達(dá)下調(diào)可能參與肺癌的發(fā)生。

越來越多的研究表明，DADS在多種腫瘤中通過不同途徑抑制腫瘤其的增殖與轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化與凋亡。Tang等[4]研究表明，DADS可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控Wnt信號通路進(jìn)而上調(diào)胃癌組織miR-200b表達(dá)可能是其作用機(jī)制。Xiao等[15]研究證實(shí)，DADS通過上調(diào)miR-34a抑制SRC/Ras信號通路，從而抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。本研究顯示，隨著DADS劑量增加，miR-200b在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)逐漸上調(diào)，且呈劑量依賴性關(guān)系。證實(shí)DADS可上調(diào)A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)。

為進(jìn)一步明確miR-200b在非小細(xì)胞肺癌中的作用及DADS對其表達(dá)的影響，本研究將miR-200b模擬物轉(zhuǎn)染染入A549細(xì)胞，使其外源高表達(dá)miR-200b，并將200μmol/LDADS與miR-200b共同作用于A549細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，外源高表達(dá)miR-200b能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖能力，將DADS與miR-200b共同作用后，細(xì)胞增殖抑制作用更為明顯；上述結(jié)果提示，miR-200b不僅能抑制肺癌細(xì)胞的增殖，還能增強(qiáng)DADS的抑瘤作用，但其作用機(jī)制尚未明確。

綜上所述，DADS能夠上調(diào)肺癌A549細(xì)胞miR-200b表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

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湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(B2015477)。

劉越峰(E-mail: yuefengliu15@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.010

R734.2

A

1002-266X(2016)44-0033-03

2015-12-06)