強(qiáng)直性脊柱炎患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中骨硬化蛋白、β-鏈蛋白表達(dá)觀察

祁偉仲，李奇，林荔軍，王宇召，陸遙

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280)

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強(qiáng)直性脊柱炎患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中骨硬化蛋白、β-鏈蛋白表達(dá)觀察

祁偉仲，李奇，林荔軍，王宇召，陸遙

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280)

目的觀察強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中骨硬化蛋白(SOST)、β-鏈蛋白(β-catenin)表達(dá)變化，并探討其意義。方法AS患者15例(觀察組)，創(chuàng)傷性骨折患者18例(對(duì)照組)，分別采別用免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)兩組髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin。結(jié)果觀察組SOST、β-catenin的IOD值分別為36.433±17.281、83.077±37.988，對(duì)照組分別為7.417±3.843、16.099±6.862，兩組比較，P均<0.05；觀察組SOST、β-catenin相對(duì)表達(dá)量分別為14.608±1.945、6.226±1.015，對(duì)照組分別為0.910±0.030、0.960±0.050，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論AS患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin表達(dá)升高。

強(qiáng)直性脊柱炎；骨硬化蛋白；β-鏈蛋白；外周關(guān)節(jié)骨化

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種骨骼及軟組織慢性進(jìn)行性風(fēng)濕性疾病，炎癥不僅累及中軸關(guān)節(jié)，而且對(duì)全身多處關(guān)節(jié)均造成慢性炎癥損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)纖維化及骨性強(qiáng)直。β-鏈蛋白(β-catenin)是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成部分，它被Wnt蛋白激活后再參與下游基因的轉(zhuǎn)錄，骨硬化蛋白(SOST)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，SOST和β-catenin的變化在骨形成的平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了AS患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin的表達(dá)變化，以探討AS外周關(guān)節(jié)異位骨化的機(jī)制，旨在尋找骨化依賴的信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2011年5月～2014年5月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院收治的AS患者15例(觀察組)，男13例，女2例；年齡(37±11)歲；診斷符合1984修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選18例創(chuàng)傷性骨折患者作對(duì)照(對(duì)照組)，男15例，女3例；年齡(52±4)歲；排除風(fēng)濕病、髖關(guān)節(jié)滑膜炎等疾病。手術(shù)留取受試對(duì)象髖關(guān)節(jié)滑膜組織。

1.2滑膜標(biāo)本制備所有標(biāo)本均經(jīng)0.9%生理鹽水清洗3～5遍，洗凈血液，分兩份處理。第一份以10%中性甲醛固定24～48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋,做連續(xù)組織切片，厚度為4 μm,留作免疫組化檢測(cè)使用。第二份在無菌操作下，切碎放入凍存管中，轉(zhuǎn)入-196 ℃低溫液氮中保存,留作Western blotting檢測(cè)使用。

1.3滑膜組織SOST、β-catenin檢測(cè)

1.3.1免疫組化SP法標(biāo)本脫蠟和水化，抗原微波熱修復(fù)15 min，PBS沖洗。滴加5%BSA封閉30 min，滴加Ⅰ抗(50倍稀釋的SOST和β-catenin)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃、30 min，PBS沖洗。滴加SABC，37 ℃、30 min，PBS沖洗。使用DAB顯色試劑著色。蒸餾水洗后蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果使用Nikon 550i顯微鏡攝像系統(tǒng)觀察及攝影。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：SOST、β-catenin以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色成棕黃色或者棕褐色為陽(yáng)性。采用Image-pro plus6.0圖像處理分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化進(jìn)行定量分析，所有切片放大倍數(shù)為400×。每張切片觀察6個(gè)視野，結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度(IOD)來表示。

1.3.2Western blotting法充分研磨組織至勻漿。取蛋白樣品，用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，取等量蛋白用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，稀釋后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗，室溫孵育2 h。α-tubulin作為內(nèi)源性參照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)兩組滑膜標(biāo)本中SOST、β-catenin灰度值，分別與對(duì)應(yīng)的α-tubulin蛋白灰度值比較，計(jì)算兩者比值。

2　結(jié)果

觀察組SOST、β-catenin的IOD值分別為36.433±17.281、83.077±37.988，對(duì)照組分別為7.417±3.843、16.099±6.862，兩組比較，P均<0.05；觀察組SOST、β-catenin的相對(duì)表達(dá)量分別為14.608±1.945、6.226±1.015，對(duì)照組分別為0.910±0.030、0.960±0.050，兩組比較，P均<0.05。

3　討論

AS是一種骨骼及軟組織慢性進(jìn)行性炎癥性疾病，主要對(duì)脊柱、全身多處關(guān)節(jié)及鄰近肌腱、韌帶造成損傷。AS患者中，約有一半以上存在外周關(guān)節(jié)發(fā)病，其中髖關(guān)節(jié)受累的發(fā)生率較高[1]。AS關(guān)節(jié)發(fā)病早期即出現(xiàn)以滑膜病變?yōu)橹鞯难装Y改變[2]，接著骨侵蝕破壞，繼而新骨形成、骨贅增生，最終發(fā)展為全關(guān)節(jié)骨化強(qiáng)直[3,4]?；び醒装Y時(shí)，各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)使局部滑膜組織血管化，聚集分化出多種潛能的前體干細(xì)胞，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞向骨性細(xì)胞分化。因此，滑膜是AS關(guān)節(jié)骨硬化和骨贅形成的特殊組織部位。正確處理AS骨化影響因素對(duì)患者診斷、預(yù)后及治療皆具有重要指導(dǎo)意義[5]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨形成的平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，激活通路后可促進(jìn)骨硬化、骨贅的形成[6，7]，故Wnt信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)控AS異位成骨的關(guān)鍵途徑之一，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能具有重要調(diào)節(jié)意義[8,9]。Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白胞外區(qū)特異性結(jié)合，此過程需與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)識(shí)別形成共受體[10]。卷曲蛋白變構(gòu)激活后，促進(jìn)β-catenin復(fù)合體解聚和抑制β-catenin單體降解，使胞內(nèi)β-catenin積聚到一定濃度后進(jìn)入胞核，后與細(xì)胞因子作用，進(jìn)行下游基因轉(zhuǎn)錄[11]。Wnt信號(hào)通路的啟動(dòng)蛋白是一類具有相同半胱氮酸殘基的分泌型糖蛋白[12,13],而作為Wnt信號(hào)抑制劑的SOST可與LRP5/6受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[14，15]，抑制信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。在對(duì)Wnt誘導(dǎo)蛋白聚合和齊聚的研究[16]中發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)LRP6受體可影響或增強(qiáng)Wnt信號(hào)的活性[17]。以上說明SOST和Wnt信號(hào)通路聯(lián)系緊密，或可通過LRP受體影響Wnt信號(hào)通路。研究[18,19]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，AS患者骨硬化蛋白低水平表達(dá)與骨贅形成存在相關(guān)性，血清水平降低的患者更易發(fā)生關(guān)節(jié)強(qiáng)直。Klingber等[20]發(fā)現(xiàn)，AS患者血清SOST水平明顯低于健康組。研究[21]報(bào)道，血清中SOST持續(xù)低水平可能是AS患者抗炎治療的結(jié)果。因此，Wnt信號(hào)抑制劑水平或成為預(yù)測(cè)AS患者骨化能力的指標(biāo)之一[22,23]，而其抑制劑水平或成為預(yù)測(cè)AS患者骨化能力的指標(biāo)之一[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組SOST、β-catenin表達(dá)較對(duì)照組升高。Wnt通路活化時(shí)，局部組織內(nèi)β-catenin表達(dá)量將增加，此結(jié)論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。而作為抑制劑的SOST，在局部滑膜組織中的表達(dá)卻明顯增高，此發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外暫未見相關(guān)報(bào)道?？紤]其增高的原因如下：①SOST通過負(fù)反饋機(jī)制抑制調(diào)節(jié)信號(hào)通路作用。在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的同時(shí)，其受體相關(guān)蛋白LRP5/6增多。而協(xié)受體的增多也需要相應(yīng)的抑制劑去中和。因此，當(dāng)出現(xiàn)LRP受體蛋白增加的情況，作為負(fù)性調(diào)控的抑制劑SOST出現(xiàn)反應(yīng)性增高。②不同部位所表達(dá)的蛋白效應(yīng)與濃度不同。在國(guó)內(nèi)外研究中，主要以檢測(cè)AS患者血清SOST水平，血清中的濃度與全身骨細(xì)胞釋放入血的蛋白水平有關(guān)。而我們此次實(shí)驗(yàn)選擇的是關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織。因解剖學(xué)關(guān)系，骨化關(guān)節(jié)的滑膜組織所代表的是局部成骨能力的體現(xiàn)。在成骨能力較強(qiáng)的組織中，作為抑制劑的SOST，其表達(dá)同樣可高于其他部位。通過免疫組化染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，SOST和β-catenin主要分布于滑膜組織中的成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中。van Bezooijen等[25]認(rèn)為，SOST在人體由骨細(xì)胞特異性分泌;但最近研究[26]在骨組織及軟骨組織中也發(fā)現(xiàn)其存在。因此，SOST的產(chǎn)生來源或許是其骨化的始動(dòng)靶點(diǎn)。有學(xué)者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是AS韌帶骨化的發(fā)生細(xì)胞[27]，AS關(guān)節(jié)囊中成纖維細(xì)胞也處于過度增殖狀態(tài)[28]。在對(duì)AS骶髂關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)[29]，骨和軟骨的破壞與成纖維細(xì)胞的增殖情況密切相關(guān)，隨著成纖維細(xì)胞增殖程度改變，局部炎癥也由侵襲破壞逐漸轉(zhuǎn)向新骨形成[30]。以此推測(cè)，成纖維樣滑膜細(xì)胞作為AS髖關(guān)節(jié)滑膜組織骨化作用的主要發(fā)生細(xì)胞可能向成骨細(xì)胞分化。

[1] Vander Cruyssen B, Muoz-Gomariz E, Font P, et al. Hip involvement in ankylosing spondylitis: epidemiology and risk factors associated with hip replacement surgery[J]. Rheumatology, 2010,49(1):73-81.

[2] 薛勤,朱家安,汪年松,等.彩色超聲評(píng)估活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者骶髂關(guān)節(jié)炎和肌腱端病變的價(jià)值[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(10):1759-1761.

[3] Joachim S, Heiner A, Jürgen B, et al. Critical appraisal of assessment of structural damage in ankylosing spondylitis: implications for treatment outcomes.[J]. Arthritis Rheumatism, 2008,58(3):649-656.

[4] Appel H, Loddenkemper C, Sieper J. Immunopathology of ankylosing spondylitis and other spondyloarthritides[J]. Z Rheumatol, 2008,67(1):25-31.

[5] Lai-Shan T, Jieruo G, David Y. Pathogenesis of ankylosing spondylitis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2010,6(7):399-405.

[6] Johnson ML, Kamel MA. The Wnt signaling pathway and bone metabolism[J]. Curr Opin Rheumatol, 2007,19(4):376-382.

[7] Daniel W, Pascal C. New bone formation in axial spondyloarthritis[J]. Joint Bone Spine Revue Du Rhumatisme, 2013,80(5):454-458.

[8] Johnson ML, Kamel MA. The Wnt signaling pathway and bone metabolism[J]. Curr Opin Rheumatol, 2007,19(4):376-382.

[9] Logan CY, Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2004,20(1):781-810.

[10] Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways[J]. Science, 2004,303(5663):1483-1487.

[11] Weidauer SE, Schmieder P, Beerbaum M, et al. NMR structure of the Wnt modulator protein sclerostin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009,380(1):160-165.

[12] Polakis P. Wnt signaling and Cancer[J]. Genes Dev, 2000,14(15):1837-1851.

[13] Nusse R. Wnt signaling in disease and in development[J]. Cell Research, 2005,15(1):28-32.

[14] Joiner DM, Ke J, Zhong Z, et al. LRP5 and LRP6 in development and disease[J]. Trends Endocrinol Metab, 2013,24(1):31-39.

[15] Roland B, Georges R. Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to regulate bone formation in the adult skeleton[J]. Endocrinology, 2007,148(6):2635-2643.

[16] Liu G, Bafico A, Harris VK, et al. A novel mechanism for Wnt activation of canonical signaling through the LRP6 receptor[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(16):5825-5835.

[17] Gong Y, Bourhis E, Chiu C, et al. Wnt isoform-specific interactions with coreceptor specify inhibition or potentiation of signaling by LRP6 antibodies[J]. PLoS One, 2010,5(9):e12682.

[18] Heiland GR, Appel H, Poddubnyy D, et al. High level of functional dickkopf-1 predicts protection from syndesmophyte formation in patients with ankylosing spondylitis[J]. Ann Rheum Dis, 2012,71(4):572-574.

[19] Appel H, Ruiz-Heiland G, Listing J, et al. Altered skeletal expression of sclerostin and its link to radiographic progression in ankylosing spondylitis[J]. Arthritis Rheum, 2009,60(11):3257-3262.

[20] Klingberg E, Nurkkala M, Carlsten H, et al. Biomarkers of bone metabolism in ankylosing spondylitis in relation to osteoproliferation and osteoporosis[J]. Rheumatol, 2014,41(7):1349-1356.

[21] Saad CG, Ribeiro AC, Moraes JC, et al. Low sclerostin levels: a predictive marker of persistent inflammation in ankylosing spondylitis during anti-tumor necrosis factor therapy[J]. Arthritis Res Ther, 2012,14(5):R216.

[22] Lories RJ, Derese I, de Bari C, et al. Evidence for uncoupling of inflammation and joint remodeling in a mouse model of Spondyloarthritis[J]. Arthritis Rheum, 2007,56(2):489-497.

[23] Maksymowych W, Chiowchanwisawakit PT, Pedersen S, et al. Inflammatory lesions of the spine on magnetic resonance imaging predict the development of new syndesmophytes in ankylosing spondylitis: evidence of a relationship between inflammation and new bone formation[J]. Arthritis Rheum, 2009,60(1):93-102.

[24] Kwon SR, Lim MJ, Suh CH, et al. Dickkopf-1 level is lower in patients with ankylosing spondylitis than in healthy people and is not influenced by anti-tumor necrosis factor therapy[J]. Rheumatol Int, 2012,32(8):2523-2527.

[25] van Bezooijen RL, Roelen BA, Visser A, et al. Sclerostin is an osteocyte-expressed negative regulator of bone formation, but not a classical BMP antagonist[J]. J Exp Med, 2004,199(6):805-814.

[26] Moester MJ, Papapoulos SE, L?wik CW, et al. Sclerostin: current knowledge and future perspectives[J]. Calcif Tissue Int, 2010,87(2):99-107.

[27] Yu F, Cui Y, Zhou X, et al. Osteogenic differentiation of human ligament fibroblasts induced by conditioned medium of osteoclast-like cells[J]. Bioscience Trends, 2011,5(2):46-51.

[28] 劉宏瀟,馮興華,李麗,等.強(qiáng)直性脊柱炎成纖維細(xì)胞增殖細(xì)胞周期及凋亡的初步研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2005,9(12):758-760.

[29] Ogawa M, LaRue AC. Origin of fibroblast colony-forming units[J]. Exp Hematol, 2007,35(9):1319-1320.

[30] Hermann KG, Bollow M. Magnetic resonance imaging of sacroiliitis in patients with spondyloarthritis: correlation with anatomy and histology[J]. Rofo, 2014,186(3):230-237.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81430031)。

李奇(E-mail： qili565@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.033

R593.23

B

1002-266X(2016)15-0086-03

2015-11-06)