脂多糖內(nèi)毒素聯(lián)合甲基潑尼松龍建立骨壞死動物模型的血管內(nèi)外變化

黃東海，霍業(yè)紅，孫紅英

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脂多糖內(nèi)毒素聯(lián)合甲基潑尼松龍建立骨壞死動物模型的血管內(nèi)外變化

黃東海，霍業(yè)紅，孫紅英＊

［摘要］目的通過對白兔先采用單次低劑量的脂多糖內(nèi)毒素注射和隨后三次高劑量的甲基潑尼松龍注射，利用不同的成像方式及病理學(xué)檢查，來研究由激素性骨壞死動物模型的血管內(nèi)外改變。方法實(shí)驗(yàn)組：11只32周齡雄性白兔；對照組：8只32周齡雄性白兔。實(shí)驗(yàn)組單次靜脈內(nèi)注射內(nèi)毒素（10 μg/kg），24 h后，肌肉注射甲基潑尼松龍（20 mg/kg），重復(fù)3次。MRI動態(tài)觀察內(nèi)毒素注射前后雙側(cè)股骨的局部骨內(nèi)灌注情況。收集內(nèi)毒素注射前后的血液樣本并做血液學(xué)檢查。解剖和脫鈣后的雙側(cè)股骨做顯微CT下的微血管成像。對激素性骨壞死，血管內(nèi)血栓形成和血管外骨髓脂肪細(xì)胞進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組91%的兔（10/11）出現(xiàn)骨壞死，且實(shí)驗(yàn)期間沒有死亡。在骨壞死陽性白兔中，無論是干骺端和骨骺均發(fā)現(xiàn)了骨壞死病變的典型特征。在骨壞死陽性白兔所有骨樣本中均未發(fā)現(xiàn)軟骨下骨的塌陷。所有對照組骨樣品中沒有觀察到組織病理學(xué)的改變。結(jié)論注射內(nèi)毒素和隨后高劑量注射甲基潑尼松龍所誘導(dǎo)的激素性股骨壞死實(shí)驗(yàn)動物中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)和血管外均有改變。實(shí)施此誘導(dǎo)方案所產(chǎn)生的骨壞死高患病率且低死亡率，提示其在激素性骨壞死實(shí)驗(yàn)研究中有一定的可行性。

［關(guān)鍵詞］成像；脂多糖內(nèi)毒素；甲基潑尼松龍；誘導(dǎo)；骨壞死；動物模型

［作者單位］475000河南開封，解放軍155醫(yī)院骨科（黃東海，霍業(yè)紅），消化內(nèi)科（孫紅英）

既往有兩種常用的建立激素性骨壞死兔子模型的經(jīng)典誘導(dǎo)方案。一種是使用單次高劑量注射甲基潑尼松龍，然而這種方法的骨壞死發(fā)生率較低［1］。另一種是兩次大劑量的脂多糖內(nèi)毒素和隨后的三次高劑量的甲基潑尼松龍，誘發(fā)了較高的發(fā)病率，但同時(shí)也導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)動物高死亡率（50%）［2］。在對激素性骨壞死的干預(yù)策略中，有必要建立新的方案來誘導(dǎo)骨壞死病變，既有較高的骨壞死發(fā)生率，又有較低的動物死亡率。筆者嘗試，單次注射低劑量脂多糖內(nèi)毒素聯(lián)合隨后的三次高劑量甲基潑尼松龍注射的實(shí)驗(yàn)方法。為了確認(rèn)上述方案建立激素性骨壞死動物模型的有效性，本研究使用傳統(tǒng)的和先進(jìn)的靜態(tài)和動態(tài)生物成像方法，來分析致病事件、病理生理途徑和結(jié)束點(diǎn)相關(guān)的骨壞死發(fā)病率和病死率。做了血管內(nèi)血栓形成和血管外骨髓脂肪細(xì)胞的組織學(xué)檢查，以及對凝血、纖溶和脂質(zhì)運(yùn)輸做血液學(xué)評價(jià)；對于研究病理生理途徑，用動態(tài)MRI和顯微CT下的微血管成像來檢查骨內(nèi)血供系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能；對激素性骨壞死的發(fā)病率和病死率分別用骨組織病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行了審查。

1　材料與方法

1.1一般資料選擇19只實(shí)驗(yàn)動物中心的雄性白兔，32周齡、體重3～4 kg，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飲食。實(shí)驗(yàn)組的11只白兔單次靜脈注射內(nèi)毒素（10 μg/kg），隨后，每間隔24h，肌肉注射1次甲基潑尼松龍（20 mg/ kg），共3次。對照組8只白兔注射0.9%的生理鹽水。在甲基潑尼松龍注射后的6周里，動態(tài)觀察骨壞死形成和壞死骨的修復(fù)過程［1，3］。最后一次注射甲基潑尼松龍6周后對兩組兔均進(jìn)行了安樂死。

1.2安樂死之前的評估

1.2.1血液學(xué)檢查從每只禁食的白兔經(jīng)耳廓?jiǎng)用}分別在注射內(nèi)毒素前、第一次注射甲基潑尼松龍前和最后一次注射甲基潑尼松龍后24 h分別采取5 ml的血液樣本，進(jìn)行血栓前狀態(tài)的評估［4，5］。

1.2.2動態(tài)MRI在內(nèi)毒素注射前和最后一次注射甲基潑尼松龍后6周，用1.5T的MRI對雙側(cè)股骨近端和股骨遠(yuǎn)端行動態(tài)掃描［6］。

1.3安樂死后評估

1.3.1灌注和脫鈣全身麻醉，在37℃條件下，用50 U/ml的肝素生理鹽水，以20 mm/min的流速沖洗。若從腹腔靜脈的切口流出清亮液體，則用10%的中性甲醛緩沖液（37℃）泵入脈管固定滋養(yǎng)骨骼肌樣品。然后用肝素生理鹽水沖洗脈管中的福爾馬林，脈管中注射Microfil。然后用過量戊巴比妥鈉使動物安樂死并儲存在4℃下1 h，以確保微血管造影前造影劑的聚合。收集雙側(cè)股骨樣品并用多聚甲醛（4%）固定，EDTA（10%，pH值7.4）脫鈣［7，8］。

1.3.2微血管成像在有經(jīng)驗(yàn)的顯微CT專家的幫助下，每個(gè)骨樣品的近端和遠(yuǎn)端分別插入一個(gè)PMMA樣品管。股骨干長軸垂直固定于管的底部。從距離底部10 mm的基準(zhǔn)線開始垂直于軸掃描，整個(gè)掃描長度為10 mm。用低通高斯濾波器去除噪聲以做血管叢背景的分割。通過內(nèi)置的脫鈣樣品中可自動重構(gòu)的3-D圖像脈管的“輪廓程序”，在每個(gè)填充有Microfil血管的二維（2-D）部分可半自動繪制輪廓，隨后生成直方圖顯示血管大小的分布，并將顏色映射到3-D圖像表面，可視化表示血管大小分布［8］。

1.3.3組織病理學(xué)微血管造影后，樣本切片用蘇木精-伊紅染色（H&E），來評價(jià)骨壞死和計(jì)算脂肪細(xì)胞大?。?，2，12］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)。P＜0.05為具有顯著性差異。

2　結(jié)果

所有形成骨壞死的兔均觀察到血管內(nèi)血栓形成。骨壞死兔的血管外骨髓脂肪細(xì)胞顯著大于對照組兔（P＜0.05）。與基值水平相比，組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制劑1和活化部分凝血活酶時(shí)間顯著降低，低密度脂蛋白/高密度脂蛋白顯著增加（P＜0.05）。動態(tài)MRI顯示，骨壞死兔的灌注指數(shù)“最大增強(qiáng)”顯著下降（P＜0.05）。顯微CT下的微血管成像顯示：骨壞死樣本中干血管形成堵塞。總體上，91%的兔（10/11）出現(xiàn)骨壞死，且實(shí)驗(yàn)期間沒有死亡。在骨壞死陽性白兔中，無論是干骺端和骨骺均發(fā)現(xiàn)了骨壞死病變的典型特征。在骨壞死陽性白兔所有骨樣本中均未發(fā)現(xiàn)軟骨下骨的塌陷。所有對照組骨樣品中沒有觀察到組織病理學(xué)的改變。

3　討論

3.1激素性骨壞死的血管內(nèi)發(fā)病機(jī)制通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，骨壞死的兔子在注射內(nèi)毒素后，纖維蛋白溶解傾向以及凝血功能與基值水平都出現(xiàn)明顯的降低。這一現(xiàn)象說明內(nèi)毒素引起了血液高凝傾向和低纖維蛋白溶解傾向［9］。本研究結(jié)果提示與人類激素性骨壞死在發(fā)生軟骨下骨塌陷之前存在的與發(fā)病事件和發(fā)病機(jī)制上的相似。在骨壞死的骨上黏附性骨生成以及在死骨周圍發(fā)現(xiàn)的纖維性肉芽組織都與人體骨壞死病灶類似［10］。

3.2激素性骨壞死的血管外骨髓發(fā)病機(jī)制盡管內(nèi)毒素引起的脂肪代謝紊亂經(jīng)常發(fā)生，可是其產(chǎn)生機(jī)制目前還不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，骨壞死兔在注射內(nèi)毒素后，血漿LDL/HDL值明顯比基值高，它說明脂肪向外周組織的轉(zhuǎn)達(dá)傾向在骨壞死家兔中占有主導(dǎo)地位，表明內(nèi)毒素與甲基潑尼松龍對骨髓的脂肪堆積存在協(xié)同加強(qiáng)作用［11，12］。

3.3血管結(jié)構(gòu)微血管造影檢查顯示骨壞死區(qū)域的病理生理存在許多與血管新生聯(lián)系的不連續(xù)的小血管樣結(jié)構(gòu)以及許多彌散性的無定型的滲漏樣結(jié)構(gòu)，說明參與骨壞死修復(fù)過程的新生血管的功能與結(jié)構(gòu)的異常。本實(shí)驗(yàn)提示能夠當(dāng)做一個(gè)評估指標(biāo)來評估潛在的干預(yù)措施是否能夠加速壞死病灶的修復(fù)。

總之，通過用單次低劑量注射內(nèi)毒素和隨后三次高劑量注射甲基潑尼松龍所誘導(dǎo)的激素性股骨壞死實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)和血管外均有改變，對兔實(shí)施此誘導(dǎo)方案所產(chǎn)生的高骨壞死患病率且低死亡率，可對以后激素性骨壞死實(shí)驗(yàn)研究提供一定指導(dǎo)。

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［2015-11-13收稿，2015-12-10修回］

［本文編輯：韓仲琪］

個(gè)案與短篇

The changes of intra- and extra-vessels of bone necrosis animal model induced by combination of LPS and methylprednisolone

HUANG Dong-hai①，HUO Ye-hong，SUN Hong-ying.①Dept. of Orthopedics，No. 155 Hospital of Chinese PLA，Kaifeng，Henan 475000，China

［Abstract］Objective The rabbits were injected with a single and low dose of lipopolysaccharide（LPS）and three doses of methylprednisolone to establish bone necrosis model，so as to study the changes of vessel＇s intra- and extertal by using different imaging modalities and pathological examination. Methods The experimental group：eleven 32 -week -old male white rabbits；control group：eight 32 -week -old male white rabbits. The experimental group of single intravenous injection of LPS（10 μg/kg），24 hours after the injection of methylprednisolone（20 mg/kg），repeated 3 times. MRI dynamic observation was taken before and after LPS injection in bilateral femoral bone perfusion；the blood samples before and after LPS injection were collected and taken blood examination. Microvascular imaging under CT was taken for decalcified bilateral femur. Steroid induced osteonecrosis，thrombosis and vascular-outside bone marrow fat cells received histopathological examination. Results In the experimental group，10 rabbits had bone necrosis，but no death. In the rabbits with bone necrosis either the metaphysis and epiphysis were found in the typical characteristics of bone necrosis；in all samples of the rabbits with bone necrosis the collapse of the subchondral bone was all not found. The control group was not observed with samples of bone tissue pathological changes. Conclusion Both intra- and extra-vascular events are found attributing to the steroid -associated ON in this study. Both high ON incidence and no mortality in rabbits treated with this inductive protocol suggested its effectiveness for further studies on evaluation of therapeutic efficacy of interventions developed for prevention of steroid-associated ON.

［Key word］Imaging；Lipopolysaccharide（LPS）；Methylprednisolone；Induction；Osteonecrosis；Animal model

［中圖分類號］R681

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.06.021

［通訊作者］孫紅英，Email：changhr2008@163.com