微小RNA在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用研究進展

王秀月，黨學(xué)娟，汪湄，王晶，陳徹

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 73000)

微小RNA在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用研究進展

王秀月，黨學(xué)娟，汪湄，王晶，陳徹

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 73000)

白血病細(xì)胞耐藥是白血病治療中的難題和急需解決的問題。微小RNA(miRNAs)是一類長度為18～25個核苷酸序列的微小單鏈非編碼RNA，有類似癌基因或抑癌基因功能，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNAs的異常表達(dá)與白血病細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。miRNAs在白血病細(xì)胞耐藥中存在著復(fù)雜且重要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；一個miRNA可靶向調(diào)控多個基因表達(dá)，多個miRNAs也可以共同調(diào)節(jié)一個靶基因；單獨一個miRNA可在白血病細(xì)胞耐藥中發(fā)揮作用，多個miRNAs也可起到協(xié)同作用或拮抗作用。校正關(guān)鍵miRNAs的表達(dá)，可以靶向調(diào)控白血病耐藥細(xì)胞的藥物敏感性。

微小RNA；白血病；化學(xué)療法；腫瘤耐藥

白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性克隆性疾病，最常用的治療方法是化療，但白血病細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)使得治療效果欠佳[1]。探討白血病細(xì)胞耐藥形成的新機制、研究逆轉(zhuǎn)耐藥的新途徑具有非常重要的臨床意義。微小RNA(miRNAs)是一類長度為18～25個核苷酸序列的微小單鏈非編碼RNA，廣泛存在于動植物中。胞核內(nèi)miRNAs基因經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)和Drosha酶剪切形成前體miRNAs(pre-miRNAs)，然后轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)內(nèi)，經(jīng)核糖核酸酶ШDicer識別剪切形成成熟的miRNAs[2]。目前發(fā)現(xiàn)超過兩千種miRNAs調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因[3]。

每個miRNA可以調(diào)節(jié)多個基因，多個miRNAs也可以共同調(diào)控某個基因。miRNAs通過與目的基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，快速、敏感地調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]，在血液系統(tǒng)腫瘤耐藥中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]?，F(xiàn)將miRNAs在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用研究進展情況綜述如下。

1 miR-181在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

miR-181家族是廣泛存在于人類細(xì)胞中的高度保守家族，包括miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d四個家族成員。miR-181家族在白血病中發(fā)揮著類似腫瘤抑制基因的作用[6]。廖旺等[7]采用實時熒光定量PCR方法檢測急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒骨髓樣本、ALL細(xì)胞株CCRF-CEM細(xì)胞及其耐藥株CEM-C1細(xì)胞中的miR-181a，發(fā)現(xiàn)CEM-C1細(xì)胞miR-181a相對表達(dá)水平較CCRF-CEM細(xì)胞明顯升高(P<0.01)，復(fù)發(fā)患兒骨髓miR-181a相對表達(dá)水平也高于對照組 (P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-181a的表達(dá)可明顯增強CEM-C1細(xì)胞的藥物敏感性，上凋miR-181a的表達(dá)能明顯增加CCRF-CEM細(xì)胞的耐藥性，轉(zhuǎn)染miR-181a抑制劑的CEM-C1細(xì)胞增殖抑制率較轉(zhuǎn)染陰性對照組明顯升高(P<0.05)。然而，Bai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對阿糖胞苷抵抗的阿糖胞嘧啶耐藥株白血病細(xì)胞中HL-60 miR-181a表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-181a可靶向下調(diào)Bcl-2基因而激活Caspase依賴性細(xì)胞凋亡，使白血病細(xì)胞對柔紅霉素、阿糖胞苷的敏感性增強。miR-181a可以作為一種“抑癌”或“促癌”基因，參與Caspase凋亡過程的調(diào)控[9]。對柔紅霉素抵抗的人白血病K562/A029細(xì)胞株和對阿糖胞苷抵抗的HL-60/Ara-C細(xì)胞株中的miR-181a表達(dá)均下調(diào)，并且校正表達(dá)miR-181a還能提高白血病耐藥細(xì)胞對柔紅霉素、阿糖胞苷的敏感性[10]。以上研究結(jié)果表明，通過改變miR-181家族的表達(dá)水平，能調(diào)節(jié)耐藥白血病細(xì)胞對部分化療藥物的敏感性。此外，在白血病耐藥細(xì)胞中，miR-181家族表達(dá)既有上調(diào)也有下調(diào)，這可能是由于靶基因的差異或者miRNA本身作用的復(fù)雜性導(dǎo)致同種miRNA在白血病耐藥中發(fā)揮不同甚至完全相反的作用。miR-181a與其靶基因相互作用的具體機制還不清楚，有待于更全面、更深入的研究。

2 miR-27a、miR-331-5p在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

miR-27a與腫瘤關(guān)系密切[11]。Chen等[12]研究證實，miR-27a通過抑制經(jīng)跨膜受體卷曲蛋白(FZD7)和β連環(huán)蛋白(β-catenin)的FZD7/β-catenin 通路，調(diào)節(jié)多藥耐藥(MDR)1基因的 P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)。MDR1基因產(chǎn)物能使癌細(xì)胞抵抗廣泛的化療藥物。P-gp是第一個被發(fā)現(xiàn)的多重耐藥蛋白，由MDR1基因編碼，通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)藥物外流而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。在探索治療耐藥白血病新途徑的研究中發(fā)現(xiàn)miR-27a和miR-331-5p的表達(dá)差異共同存在且方向一致，黃禮彬等[13]對兒童急性白血病(AL)耐藥相關(guān)的miRNAs進行尋找，用不同濃度阿霉素(DOX)培養(yǎng)K562細(xì)胞，建立耐DOX的白血病細(xì)胞株K562(K562/DOX)，初步篩選發(fā)現(xiàn)K562/DOX細(xì)胞株中miR-20a、miR-188-3p、miR-214等表達(dá)上調(diào)，而miR-27a、miR-331-5p、miR-15a、miR-338-5p、miR-455-3等表達(dá)明顯下調(diào)。進一步的研究證實miR-27a和miR-331-5p的表達(dá)方向與P-gp的表達(dá)相反；最后在骨髓樣本中再次驗證兒童AL耐藥細(xì)胞中存在miR-331-5p和miR-27a差異表達(dá)譜。推測miR-331-5p和miR-27a是與兒童AL耐藥相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs。與親代K562細(xì)胞株相比，白血病細(xì)胞耐藥株有不同程度的抗DOX的miRNAs表達(dá)，其中miR-331-5P和miR-27a的表達(dá)與耐藥因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[14]。為了驗證體外實驗結(jié)果，研究者[14]用miR-331-5P、miR-27a單獨或組合轉(zhuǎn)染K562和人早幼粒細(xì)胞白血病阿霉素耐藥細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞對阿霉素的敏感性增加。提示校正miRNAs的表達(dá)，可消除白血病細(xì)胞耐藥的現(xiàn)象。重要的是，白血病復(fù)發(fā)患者體內(nèi)miR-331-5P和miR-27a的表達(dá)水平低于原發(fā)患者，進一步說明白血病耐藥復(fù)發(fā)可能是miR-331-5P和miR-27a表達(dá)下調(diào)的結(jié)果。以上研究結(jié)果表明，miR-27a和miR-331-5p與白血病細(xì)胞耐藥關(guān)系密切，而且還提示miR-27a和miR-331-5p可能存在相互協(xié)同效應(yīng)關(guān)系。因此，不僅可以通過靶向調(diào)節(jié)單個miRNA來逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥，還可以利用miRNAs之間的相互作用調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞耐藥。然而，miR-27a和miR-331-5p的相互作用機制尚不清楚。此外，是白血病耐藥導(dǎo)致miRNAs表達(dá)差異，還是miRNAs導(dǎo)致白血病細(xì)胞耐藥，需要進一步研究。

3 miR-17-92基因簇在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

多順反子miR-17-92基因簇是位于染色體13q31的miRNA，它編碼miR-18a、miR-17、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a。Brockway等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇的表達(dá)和WEE1蛋白激酶的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。WEE1蛋白激酶是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，可抑制細(xì)胞周期進程，也是這個集群中的5個miRNAs的靶目標(biāo)，WEE1蛋白激酶在白血病細(xì)胞中是miR-17-92基因簇的有效靶標(biāo)。之前研究發(fā)現(xiàn)，通過設(shè)計特異性寡核苷酸靶內(nèi)拮抗miR-17，不僅可以使miR-17表達(dá)下調(diào)，還可減少慢性淋巴細(xì)胞白血病中MEC-1細(xì)胞增殖。隨后在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠實驗中證明靶向拮抗miR-17可以顯著提高小鼠生存率[16]。Harada等[17]證明地塞米松可使ALL細(xì)胞株RS4中的miRNAs表達(dá)下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)miR17-92集群是對地塞米松誘導(dǎo)抑制的重要靶標(biāo)。下調(diào)miR-17在地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中占有重要角色，暗示靶向miR-17可以改善急性髓細(xì)胞白血病(AML)的治療效果。以上研究提示靶向下調(diào)miR-17-92基因簇中的成員有助于白血病的治療，進而可減少白血病細(xì)胞耐藥。但有關(guān)miR-17-92基因族內(nèi)部的相互作用關(guān)系還需要進一步的深入研究。

4 Let-7家族在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

人的let-7家族由12個成員組成，包括Let-7a(1-3)、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f(1-2)、Let-7g、Let-7i及miR-98。Chen等[18]對miRNAs靶向作用的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)及其受體CXCR4軸(SDF-1α/CXCR4)進行檢測后發(fā)現(xiàn)，CXCR4激活劑和CXCR4抑制劑分別可以下調(diào)、上調(diào)miRNAs的表達(dá)。此研究還確定了Yin Yang 1 (YY1)轉(zhuǎn)錄因子是連接Let-7a與SDF-1α/CXCR4的橋梁。進一步的體外實驗表明，SCID小鼠生存期大大延長的原因是移植人類Let-7a過表達(dá)的AML細(xì)胞使得其對阿糖胞苷的感敏度提高。此研究證明了在AML細(xì)胞中CXCR4的具體耐藥機制是通過下調(diào)let-7a促進YY1介導(dǎo)的MYC基因和BCLXL基因的轉(zhuǎn)錄激活，使得白血病耐藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到進一步完善。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Let-7a-3的過表達(dá)在AML中很常見，并且與AML不良預(yù)后有關(guān)。Ko等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Let-7a-3的甲基化與AML髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白-A( CEBPA)的甲基化相關(guān)，且Let-7a-3可以作為CEBPA低甲基化的AML患者的預(yù)后標(biāo)志物。還有研究[21]發(fā)現(xiàn)，Let-7f在難治性AML細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，并且Let-7f參與DOX耐藥的白血病細(xì)胞的耐藥過程。以上研究表明，Let-7家族的多數(shù)成員在對白血病耐藥的調(diào)控中各有不同的作用。

5 miR-155在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

miR-155參與許多不同惡性腫瘤的發(fā)病過程，發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用[22～24]。Ruvolo[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155的靶基因包含蛋白磷酸酶2A(PP2A)亞基B56α。PP2A是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族成員，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)和控制腫瘤抑制基因(如p53)和癌基因(如Bcl-2、myc)的表達(dá)。在許多腫瘤中，PP2A活性的喪失導(dǎo)致關(guān)閉生存信號通路失敗，從而驅(qū)動了腫瘤的耐藥性。但在白血病細(xì)胞中，miR-155和B56α的關(guān)系仍需要探索。

6 其他miRNAs在白血病細(xì)胞耐藥中的調(diào)控作用

有學(xué)者[26]通過初篩慢性粒細(xì)胞白血病(CML)急變細(xì)胞系K562和DOX耐藥株K562/A02的miRNAs，發(fā)現(xiàn)22種miRNAs存在差異表達(dá)，表達(dá)差異顯著的包括miR-155、miR-451、miR-424、miR-221、Let-7f，其中miR-155、miR-221及miR-451表達(dá)上調(diào)，而let-7f、miR-424表達(dá)下調(diào)。這一研究結(jié)果表明，這些miRNAs可能通過調(diào)控耐藥有關(guān)基因的表達(dá)，或者是調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因的作用而參與白血病細(xì)胞耐藥這一生物學(xué)過程，并且提示差異表達(dá)的miRNAs可作為逆轉(zhuǎn)白血病耐藥的新靶點。

Wang等[27]基于miRNAs表達(dá)譜的芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與正常CD34陽性細(xì)胞相比，CML細(xì)胞中miR-486表達(dá)明顯上調(diào)，尤其是在巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞中；進一步的研究表明，在CML祖細(xì)胞中miR-486-5p的表達(dá)增加與激酶的依賴性和非依賴性機制有關(guān)，抑制miR-486-5p表達(dá)可以降低伊馬替尼治療CML后的祖細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡。盡管伊馬替尼在CML治療中取得了巨大成功，但在一定比例的患者中出現(xiàn)了耐藥，原因是ABC轉(zhuǎn)運蛋白的過表達(dá)。

Zhi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，HL-60細(xì)胞中miR-10a的表達(dá)水平明顯高于組織細(xì)胞淋巴瘤U937細(xì)胞系，在HL-60/ADR細(xì)胞株中的表達(dá)比在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)明顯高。推測miR-10a的高表達(dá)可能與AML細(xì)胞的增殖和耐藥相關(guān)(M3除外)。此研究提示miR-10a可用于部分白血病診斷分型和耐藥白血病的治療。

Yu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，靶向調(diào)控miR-30a介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，可以增強伊馬替尼對CML細(xì)胞的殺傷活性。miR-30a是通過下調(diào)Beclin1和Atg5的表達(dá)而有效抑制細(xì)胞自噬，miR-30a類似物通過短發(fā)夾RNA增強伊馬替尼的細(xì)胞毒性。提示表達(dá)失調(diào)的miR-30a可能干擾伊馬替尼通過細(xì)胞自噬依賴性途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效果，或者可能是一個潛在的治療CML的靶點。

綜上所述，miRNAs在白血病細(xì)胞耐藥中存在著復(fù)雜且重要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一個miRNA可靶向調(diào)控多個基因，多個miRNAs也可以共同調(diào)節(jié)一個靶基因。一個miRNA可在白血病細(xì)胞耐藥中發(fā)揮起作用，多個miRNAs也可起到協(xié)同作用或拮抗作用。因此，校正關(guān)鍵miRNAs的表達(dá)，可以靶向調(diào)控白血病耐藥細(xì)胞的藥物敏感性。此外，miRNAs的表達(dá)差異也可以作為白血病治療中的療效評價指標(biāo)之一。所以，明確與白血病細(xì)胞耐藥有關(guān)的miRNAs特異性表達(dá)譜很關(guān)鍵，驗證miRNAs參與耐藥的具體機制也非常重要。今后應(yīng)該重點探索miRNAs調(diào)節(jié)的靶耐藥基因、miRNAs的相互作用關(guān)系網(wǎng)及其參與的白血病細(xì)胞耐藥作用通路，以期開辟逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥的新途徑。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81460456)；甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(1308RJZA169)。

陳徹(E-mail: chen72123@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.037

R733.7

A

1002-266X(2016)43-0111-04

2016-08-01)