轉(zhuǎn)染miR-101類似物后卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性的變化及其機制

胡可可，劉小敏，宋泓，于淵毅

(1郴州市第一人民醫(yī)院，南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院，湖南郴州 423000；2南華大學(xué)腫瘤研究所)

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轉(zhuǎn)染miR-101類似物后卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性的變化及其機制

胡可可1，劉小敏2，宋泓1，于淵毅1

(1郴州市第一人民醫(yī)院，南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院，湖南郴州 423000；2南華大學(xué)腫瘤研究所)

目的 觀察轉(zhuǎn)染miR-101類似物后卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性變化，并探討其機制。方法 培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞，將SKOV3細胞分為觀察組、對照組、單藥組，三組均經(jīng)0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇處理，觀察組轉(zhuǎn)染miR-101類似物，對照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，單藥組不轉(zhuǎn)染任何序列，MTT法觀察各組細胞增殖能力，AnnexinV-FITC/PI法測算各組細胞凋亡率。采用Western blotting法檢測25 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組、對照組、單藥組細胞DNMT3A蛋白。結(jié)果 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組細胞OD值分別為0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007，單藥組分別為0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011，對照組分別為0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008，觀察組與對照組相比，P均<0.05。0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組細胞凋亡率分別為9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%，單藥組分別為3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%，對照組分別為3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%，觀察組與對照組相比，P均<0.05。觀察組、對照組、單藥組細胞中DNMT3A蛋白相對表達量分別為0.427±0.068、0.961±0.107，0.947±0.113，三組比較，P<0.05。結(jié)論 轉(zhuǎn)染miR-101類似物后卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性增強，miR-101可能通過靶向調(diào)控DNMT3A誘導(dǎo)卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。

微小RNA-101類似物；卵巢癌細胞；甲基化轉(zhuǎn)移酶3A；紫杉醇；藥物敏感性

紫杉醇是廣泛用于治療卵巢癌的化療藥物，盡管卵巢癌患者在最初應(yīng)用紫杉醇為基礎(chǔ)的化療方案上取得了一定的效果,但最終易對其產(chǎn)生抗藥性[1]。目前研究[2,3]已證實，一些機制參與紫杉醇抗藥性，如多藥轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白表達上調(diào)、微管蛋白同型抗原的選擇性表達、Bcl-2的表達下調(diào)以及異常的細胞信號通路。然而，紫杉醇耐藥的整體分子機制至今仍然尚未完全闡明。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、非編碼RNAs分子，其通過抑制靶基因mRNA的活性或轉(zhuǎn)錄，從而沉默該基因的表達。miRNA在不同的細胞學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，如細胞的增殖、分化以及凋亡，可作為腫瘤診斷與預(yù)后分子標志物[4]。近年來，越來越多的研究關(guān)注miRNA在藥物抵抗或藥物敏感性中的作用，大量的研究表明miRNA通過調(diào)控相關(guān)靶蛋白，包括藥物轉(zhuǎn)運蛋白、細胞凋亡調(diào)節(jié)因子以及細胞周期相關(guān)復(fù)合物等，從而影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。miR-27a[5]、miR-106a[6]、miR-487[7]通過調(diào)控不同靶基因的表達影響藥物抵抗的發(fā)展。miR-101在多腫惡性腫瘤中表達下調(diào)并起類似于抑癌基因樣作用[8,9]。前期研究[10]表明，miR-101通過靶向調(diào)控DNMT3A抑制人卵巢癌細胞生長與侵襲，是否會影響卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性尚未見報道。本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-101模擬物后人卵巢癌細胞株SKOV3對紫杉醇的敏感性，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞株SKOV3由中山大學(xué)腫瘤研究所惠贈；Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；MTT購于美國Sigma公司；miR-101模擬物(5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3′)和無關(guān)序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)均由Exiqon公司設(shè)計合成；紫杉醇注射液由郴州市第一人民醫(yī)院腫瘤科提供；DNMT3A和β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；PRIM1640培養(yǎng)基和小牛血清購自Gibco公司。

1.2 紫杉醇處理及細胞分組方法 培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞，將細胞分為觀察組、對照組、單藥組，按2 mL/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞匯合度達50%，分別將0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液加至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞48 h，用于轉(zhuǎn)染。用滅菌的無酶水稀釋各種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒干粉，按說明配制成20 μmol/L的溶液備用。用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋100 pmol轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與5 μL的Lipofectamin2000，混勻，室溫孵育5 min。觀察組轉(zhuǎn)染miR-101模擬物，對照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，單藥組不轉(zhuǎn)染任何序列，培養(yǎng)48 h，收獲細胞。

1.3 卵巢癌SKOV3細胞增殖檢測 采用MTT法。分別將上述三組SKOV3細胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)至臨近90%匯合度，每孔加滅菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后取出，然后每孔再加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，選擇波長為570 nm，在酶標儀上測定各孔OD值，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。OD值代表細胞增殖能力。

1.4 卵巢癌SKOV3細胞凋亡檢測 采用AnnexinV-FITC/PI法。收集上述各組處理并培養(yǎng)至80%左右匯合度細胞，用PBS液洗滌細胞2次，離心，取約1×106個細胞，加入100 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細胞。加5 μL Annexin V-FITC混勻，再加1 μL的PI混勻。室溫下避光反應(yīng)15～30 min，上機，流式細胞儀檢測。結(jié)果判定：以AnnexinV為橫軸，PI為縱軸；左上象限為機械性損傷細胞，右上象限為晚期凋亡細胞或者壞死細胞，左下象限為正常細胞，右下象限為早期凋亡細胞，細胞凋亡率為右上與右下兩者細胞數(shù)之和與總細胞數(shù)比值。

1.5 卵巢癌SKOV3細胞DNMT3A蛋白檢測 采用Western blotting法。選擇25 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組、對照組、單藥組細胞。收集并提取三組SKOV3細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白濃度，100 ℃水浴10 min，取等量的總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后分別加入鼠抗人DNMT3A單克隆一抗，4 ℃封閉過夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白熒光檢測試劑盒顯示結(jié)果于X線片。掃描蛋白定量，計算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞OD值比較 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組細胞OD值分別為0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007，單藥組分別為0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011，對照組分別為0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008，觀察組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，單藥組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組細胞凋亡率比較 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的觀察組細胞凋亡率分別為9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%，單藥組分別為3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%，對照組分別為3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%，觀察組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，單藥組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組DNMT3A蛋白表達比較 觀察組、對照組、單藥組卵巢癌細胞中DNMT3A蛋白相對表達量分別為0.427±0.068、0.961±0.107，0.947±0.113，三組比較，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的一種腫瘤，其病死率在全球女性中居第二位[11]。由于缺乏特異性早期癥狀和可靠的早期診斷方法，卵巢癌早期診斷率非常低。因而，手術(shù)加術(shù)后輔助性化療是卵巢癌的主要治療模式。然而，化療藥物的毒副作用以及癌細胞對化療藥物抵抗極大降低了治療的有效性[12]。因此，進一步研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制，以尋找與開發(fā)有效的靶向治療藥物成為當務(wù)之急。

大量的研究表明,miRNA在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、凋亡、新陳代謝以及腫瘤的形成[13]。近年來，越來越多的研究關(guān)注miRNA在逆轉(zhuǎn)藥物的耐藥性與調(diào)節(jié)腫瘤細胞對化療藥物敏感性方面的作用。研究[14]發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在卵巢癌中表達失調(diào)，如miR-30c、miR-130a、miR-335在卵巢癌中表達下調(diào)，并且直接參與化療藥物抗藥性的發(fā)展過程。miR-21在卵巢癌中表達下調(diào)不僅能促進卵巢癌細胞發(fā)生凋亡，并且還能調(diào)節(jié)癌細胞對化療藥物的敏感性[15]。在卵巢癌中，miR-141通過直接靶向KEAP1基因誘導(dǎo)順鉑對癌細胞產(chǎn)生抵抗[16]，而miR-21-3p通過靶向NAV3基因誘導(dǎo)紫杉醇對癌細胞產(chǎn)生抵抗[17]。而另一方面，一些miRNA高表達能增強化療藥物的敏感性。He等[18]研究顯示，miR-152能增強卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。而Zhou等[19]研究報道，miR-449a通過下調(diào)NOTCH1能增強紫杉醇誘導(dǎo)的細胞毒性。由此可見，不同的miRNA通過靶向不同的基因在卵巢癌中發(fā)揮不同的作用。

研究顯示，miR-101在胃癌[8]、結(jié)腸癌[9]、乳腺癌[20]以及前列腺癌[21]中表達下調(diào)，并且通過靶向調(diào)控不同基因的表達發(fā)揮不同生物學(xué)作用。如miR-101通過靶向Stathmin可抑制乳腺癌細胞生長與轉(zhuǎn)移[20]。miR-101通過靶向調(diào)控EZH2可抑制前列腺癌干細胞增殖[21]。miR-101通過靶向調(diào)控EP4可抑制結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲[9]。可見miR-101在多種腫瘤中具有抑癌作用。紫杉醇是從紅豆杉樹皮中提取的具有抗癌作用的天然廣譜抗腫瘤藥物，可促進細胞微管蛋白聚合、維持已聚合微管蛋白的穩(wěn)定、抑制細胞有絲分裂，從而實現(xiàn)抗癌效應(yīng)[22]。紫杉醇是一種細胞毒性化療藥物，常用于卵巢癌的治療，不良反應(yīng)主要為骨髓抑制、心臟毒性、超敏反應(yīng)等。本研究通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度紫杉醇作用后卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力逐漸下降，而miR-101與不同濃度紫杉醇作用后卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力下降尤為顯著。凋亡實驗顯示，經(jīng)不同濃度紫杉醇作用卵巢癌SKOV3細胞后，細胞的凋亡率逐漸增加，而miR-101與不同濃度紫杉醇作用卵巢癌SKOV3細胞后，細胞的凋亡率增加尤為顯著。上述結(jié)果提示，miR-101能增強紫杉醇的增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡的作用。DNMT3A是miR-101直接調(diào)控的靶基因[23]，是一種從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，主要調(diào)節(jié)哺乳動物CpG甲基化。高甲基化水平使抑癌基因沉默，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究表明，DNMT3A在乳腺癌[24]、肝癌[25]、胃癌[26]等惡性腫瘤中高表達。作為miR-101的靶基因，DNMT3A是否參與了miR-101對紫杉醇的抗癌敏感性調(diào)節(jié)呢？本研究檢測了miR-101與紫杉醇對DNMT3A蛋白表達影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-101類似物卵巢癌細胞DNMT3A蛋白表達水平較對照組、單藥組下降顯著。

綜上所述，轉(zhuǎn)染miR-101類似物后卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性增強，miR-101可能通過靶向調(diào)控DNMT3A誘導(dǎo)卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。

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Sensitivity change of ovarian cancer cells transfected with miR-101 analogues to paclitaxel

HUKeke1,LIUXiaomin,SONGHong,YUYuanyi

(1ChenzhouNo.1people'sHospital,ChenzhouHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Chenzhou423000,China)

Objective To observe the sensitivity change of ovarian cancer cells transfected with miR-101 analogues to paclitaxel, and to explore its mechanism. Methods Ovarian cancer cells SKOV3 were cultivated and divided into 3 groups: the observation group, control group and single drug group. Three groups were treated with 0, 6.25, 25, 100, 400 and 1 600 ng/mL paclitaxel. The observation group was transfected with miR-101 mimics, control group was transfected with unrelated sequence and single drug group was not transfected with any sequence. MTT was conducted to observe the proliferation ability of cells in each group. Annexin V/propidium iodide staining was employed to detect the apoptosis rate in each group. Western blotting was employed to detect the protein expression of DNMT3A in these three groups which were respectively treated by 25 ng/mL paclitaxel.Results The OD values of the observation group were 0.632±0.014, 0.554±0.012, 0.503±0.015, 0.428 ± 0.011, 0.346±0.006 and 0.301±0.007, respectively. The OD values of the single drug group were 0.718 ±0.013, 0.687±0.015, 0.619±0.011, 0.554±0.009, 0.473±0.008 and 0.420±0.011, respectively. The OD values of the control group were 0.713±0.016, 0.671±0.011, 0.626±0.010, 0.549±0.008, 0.467±0.010 and 0.412±0.008, respectively. The differences were of statistical significance between the observation group and control group (allP<0.05). The apoptosis rates of the observation group were 9.63%±0.38%, 14.71%±0.64%, 21.27%±0.79%, 27.05%±0.92%, 31.82%±1.07%, 35.51%±1.63%, respectively. The apoptosis rates of the single drug group were 3.61%±0.24%, 6.18%±0.48%, 9.57%±0.42%, 15.64%±0.75%, 18.79%±1.12% and 22.05%±1.34%, respectively. The apoptosis rates of the control group was 3.74%±0.29%, 6.02%±0.35%, 10.63%±0.58%, 15.21 %±0.84%, 19.37%±1.26% and 23.30%±1.18%, respectively. The differences were of statistical significance between the observation group and control group (allP<0.05). The expression of DNMT3A protein in the observation group, control group and single drug group were 0.427±0.068, 0.961±0.107 and 0.947±0.113, respectively. The differences were of statistical significance among these three groups (P<0.05). Conclusion MiR-101 analog can increase the sensitivity of ovarian cancer cells to paclitaxel through targeted-regulating DNMT3A.

miR-101 analogues; ovarian carcinoma cells; methylation transferase 3A; paclitaxel; drug susceptibility

國家自然科學(xué)基金資助項目(81101988)。

胡可可(1979-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤的研究。E-mail: 2638419564@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.004

R737.31

A

1002-266X(2016)35-0013-04

2016-03-09)