冷凍保存技術(shù)在動(dòng)物遺傳資源保護(hù)策略中的潛力

侯 磊?。ㄉ綎|省泰安市畜牧獸醫(yī)局　271000）

冷凍保存技術(shù)在動(dòng)物遺傳資源保護(hù)策略中的潛力

侯 磊（山東省泰安市畜牧獸醫(yī)局271000）

通過(guò)冷凍保存技術(shù)對(duì)家畜的遺傳物質(zhì)進(jìn)行異位保護(hù)是對(duì)這些物種遺傳多樣性保護(hù)的一種重要策略。冷凍保存技術(shù)的發(fā)展有助于保護(hù)策略的完善，不同物種遺傳物質(zhì)類(lèi)型的選擇取決于保護(hù)目標(biāo)、技術(shù)可行性（如收集、冷凍保存）、成本和實(shí)際環(huán)境。

目前，家畜全球多樣性正日益受到威脅。在世界范圍內(nèi)，大量家畜品種處于極危狀態(tài)，有的品種已經(jīng)滅絕。在6379個(gè)家畜品種中，處于極危狀態(tài)的占9%，處于瀕危狀態(tài)的則占到了39% 。家畜遺傳多樣性的下降并亟待保護(hù)已在全世界達(dá)成共識(shí)。（1）為了滿足不斷變化的消費(fèi)以及育種和選擇的要求，家畜品種內(nèi)和品種間多樣性的保護(hù)同樣重要。在稀有或?yàn)l危品種小的有效保種群體中，必須監(jiān)測(cè)并制定計(jì)劃以維持品種間多樣性。盡管目前地方品種和商用品種間特異性狀的漸滲雜交還十分有限，Notter就已提出：與植物一樣，低產(chǎn)品種中也可能存在有用基因，并推薦了應(yīng)用于遺傳資源評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用的系統(tǒng)計(jì)劃。遺傳多樣性的保護(hù)有多種選擇?？偟膩?lái)說(shuō)，作為一種品種保護(hù)機(jī)制，原位保護(hù)或通過(guò)利用加以保護(hù)是首選，因?yàn)橐粋€(gè)品種必須進(jìn)化才能適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，豐富的遺傳多樣性才能滿足推出新產(chǎn)品的要求，理想的保種策略應(yīng)保護(hù)有發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用價(jià)值的種質(zhì)資源。除了原位保護(hù)，還建立了一些技術(shù)或方法來(lái)保護(hù)稀有品種和應(yīng)用較廣的商業(yè)品種。這些方法或技術(shù)有的是在生產(chǎn)外維持一定數(shù)目的活體，有的是在他們的自然環(huán)境之外的地方維持一定數(shù)目的活體（異位活體），有的則是通過(guò)生殖質(zhì)進(jìn)行異位保護(hù)。對(duì)保存現(xiàn)有等位基因多樣性供將來(lái)應(yīng)用來(lái)說(shuō)，生殖質(zhì)的冷凍保存是一種很好的異位保護(hù)策略。（2）異位保護(hù)策略能滿足多種目標(biāo)需求，逐漸引起人們更多的關(guān)注。異位保護(hù)可代表保護(hù)的整體構(gòu)成，有的策略主要集中在稀有品種生殖質(zhì)的保存上，但總體來(lái)說(shuō)在異位保護(hù)樣品收集上達(dá)成了這樣的共識(shí)：為了在保護(hù)中獲得盡可能多的等位基因或遺傳多樣性，應(yīng)該收集所有品種的樣品。當(dāng)動(dòng)物遺傳資源的原位保護(hù)或利用不依賴高科技方法或設(shè)備時(shí)，異位保護(hù)的效率和效能就必然得益于冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。由于異位保護(hù)成本相當(dāng)昂貴，對(duì)冷凍保存技術(shù)的優(yōu)先次序、不同方法、未來(lái)應(yīng)用和好處上仍存在爭(zhēng)論。

本文在綜述了家畜冷凍保存最新技術(shù)狀態(tài)后，討論了異位保護(hù)策略的實(shí)質(zhì)。

1　冷凍保存技術(shù)狀態(tài)

1.1低溫生物學(xué)原理（1）低溫生物學(xué)在上世紀(jì)下半葉取得了重大進(jìn)展，大多是由實(shí)驗(yàn)研究獲得。冷凍保存允許生物材料在幾千年或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)不變質(zhì)。近幾年，冷凍生物學(xué)基礎(chǔ)理論的發(fā)展極大地推動(dòng)了學(xué)科的發(fā)展。（2）在被稱為“慢速冷卻”的方法中，生物材料以一定的速率范圍冷卻，該范圍內(nèi)，冷卻速率既可避免慢速冷卻損傷，但同時(shí)又足夠慢，使細(xì)胞進(jìn)行充分地脫水，防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。留在冰晶中未冷凍片斷中的脫水細(xì)胞最終達(dá)到穩(wěn)定的玻璃化狀態(tài)，或稱“玻璃化”。在這種稱為玻璃化的方法中，通過(guò)在冷凍前加入高濃度的抗凍劑降低細(xì)胞中水的含量，因此，一點(diǎn)冰晶也無(wú)法形成，整個(gè)樣品呈玻璃化狀態(tài)。這使得較快冷凍速率下，也不會(huì)出現(xiàn)危險(xiǎn)。較高的冷卻/解凍速率可使玻璃化溶液中抗凍劑的濃度最低。極高的冷卻速率下，即使不加抗凍劑也可完成玻璃化。

1.2精液（1）大多數(shù)家畜的精液可成功冷凍，而且對(duì)許多家禽、家畜已有專門(mén)的冷凍介質(zhì)和用于采集、分裝、冷凍和人工授精的設(shè)備，這些介質(zhì)和設(shè)備都可買(mǎi)到。已在牛的人工授精（AI）中進(jìn)行了精液“耐凍性”選擇，解凍后的精液品質(zhì)相當(dāng)好，有活力的精子可達(dá)50%～70%，若提高輸精量，使用凍精獲得的妊娠率或產(chǎn)仔率可達(dá)到鮮精的水平。對(duì)其它的哺乳類(lèi)家畜，總的來(lái)說(shuō)解凍后頂體質(zhì)膜完整或有活力的精子百分率稍低，但對(duì)大多數(shù)物種而言，在精子成活力上差異不大。在許多動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)凍精的受精力要比鮮精差，這主要取決于輸精部位、雌性生殖道形態(tài)、鑒別發(fā)情或排卵的能力，綿羊凍精子宮頸輸精效果就比鮮精差很多，目前國(guó)外主要采用腹腔微創(chuàng)手術(shù)進(jìn)行人工授精，受胎率能達(dá)到60%以上。精液耐凍性隨品種和公畜的不同顯出相當(dāng)大的差異，一些遺傳上特殊的品種或公畜冷凍精液也許就不適合作基因庫(kù)資源，利用效率較低。（2）在家禽上，精液冷凍技術(shù)在雞、火雞、鵝和鴨上呈現(xiàn)出相同的解凍后精子活力，活精子的比例可達(dá)到60%。已有用解凍精液在主要家禽品種中進(jìn)行人工授精收到良好效果的報(bào)道。但正如Hammerstedt和Graham的文章所指出的，在卵子受精率的研究上，各報(bào)道有明顯的差異，結(jié)果從9%到91%不等。而且用冷凍精液在雞上達(dá)到最高受精水平所需的精子數(shù)要比使用鮮精時(shí)高許多。（3）緩沖液在不同綱間和同綱異種間存在巨大差異。大多數(shù)緩沖液具有鹽或糖的滲透性，緩沖液的適當(dāng)?shù)臐舛葟?.2～1.5mol/L不等。緩沖液中有眾多保護(hù)性大分子添加物，多數(shù)為牛奶或卵黃成分或是植物源性的脂質(zhì)成分。牛奶和卵黃主要添加到哺乳動(dòng)物精液緩沖液中，這些大分子物質(zhì)在冷卻、冰凍和解凍時(shí)保護(hù)精子。（4）甘油作為一種適宜的抗凍劑廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)。但是在家禽中發(fā)現(xiàn)甘油可以避孕，因此家禽精液解凍后必須將甘油去除。不同物種所使用的抗凍劑差異很大，相同物種同一種抗凍劑在有的研究中效果很好，而在另一種研究中卻不適合。甘油在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中都有應(yīng)用。在家禽上，二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、DMA（二甲基乙酰胺）、DMP（NN-二甲酰胺）經(jīng)常用到。（5）精液一般通過(guò)“慢速冷卻”法進(jìn)行冷凍保存，研究發(fā)現(xiàn)最優(yōu)冷卻速率大多集中在10～100/min℃的范圍內(nèi)。在一定程度上，報(bào)道中的差異可能跟抗凍劑的種類(lèi)和濃度有關(guān)。一個(gè)極端的例子就是當(dāng)雞的精液用二甲基乙酰胺而不是甘油作抗凍劑時(shí)，冷卻速率在600/min℃效果最好。細(xì)胞膜對(duì)不同抗凍劑的通透性變化較大，同時(shí)抗凍劑也影響膜對(duì)水的通透性。這些參數(shù)不僅影響了細(xì)胞的脫水速率，也影響最優(yōu)冷卻速率。

1.3卵母細(xì)胞過(guò)去的十年中，卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)得到了巨大發(fā)展。已有許多動(dòng)物卵母細(xì)胞解凍后成熟、受精和胚胎發(fā)育成功的報(bào)道。在牛、鼠、大鼠、馬和人上已有利用冷凍保存的卵母細(xì)胞產(chǎn)生胚胎并最終獲得成活胎兒的報(bào)道，但其效率和可靠性仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冷凍胚胎。在家禽和魚(yú)上卵母細(xì)胞的冷凍保存未獲成功。這是由于鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞體積較大，脂類(lèi)含量較高以及其兩極構(gòu)造（動(dòng)物極和植物極）。

1.4胚胎或胚胎細(xì)胞牛胚胎的冷凍保存非常成功，慢速冷凍和玻璃化方法都很有效。冷凍保存的成功依賴于胚胎所處的時(shí)期，如囊胚的凍存效果特別好。在重要家畜種類(lèi)上已有利用凍存的胚胎獲得成活后代的報(bào)道。豬胚胎的冷凍保存一直是個(gè)難題，這主要是因?yàn)樨i胚胎的冷敏感性和它較高的脂類(lèi)含量。近期的研究主要集中在解決這些問(wèn)題以及尋找能在豬胚胎冷凍保存中成功應(yīng)用的玻璃化方法上。

1.5體細(xì)胞多種類(lèi)型體細(xì)胞的冷凍保存已被實(shí)驗(yàn)證明是可行的。早期研究發(fā)現(xiàn)，加入5%～10%適宜的抗凍劑如甘油、DMSG到培養(yǎng)基細(xì)胞懸液中，將帶幾毫升懸液的培養(yǎng)管放到-80℃冷凍設(shè)備中保存，該方法目前仍然在有效利用。但是用這種簡(jiǎn)單方法不能控制冷卻速率，事實(shí)上在很多文章中冷卻速率都是不可控的，只有皮膚成纖維細(xì)胞等很少的研究中使用了控溫冷凍設(shè)備。

1.6進(jìn)展（1）對(duì)低溫生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的更多關(guān)注將使冷凍保存方法獲得更大發(fā)展。一種基礎(chǔ)方法已廣泛應(yīng)用于有關(guān)哺乳動(dòng)物精液和胚胎的研究中，但卻較少應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)精液研究。最近提出了一種估計(jì)適用于“慢速冷卻”冷凍方法最優(yōu)程序的理論模型。這一模型表明非線性冷卻圖要比線性圖的冷卻程序效果更好。與其它模型一樣，該模型也證明最優(yōu)冷卻速率可與抗凍劑濃度互相影響，這也在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)過(guò)，因此在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)研究中確定這兩個(gè)因素很重要。改善冷凍方法可提高冷凍的整體水平，即使用較差冷凍設(shè)備處理的精子也能夠獲得足夠的解凍后活力。（2）對(duì)精子玻璃化的嘗試尚未成功。最近表明在沒(méi)有抗凍劑下利用極高的冷卻速度（72000/min）℃，有可能使人的精子玻璃化，只有這種條件下，才能避免由于抗凍劑的存在所造成的損壞、凍傷和冰晶的形成。玻璃化技術(shù)的進(jìn)一步完善對(duì)冷敏感細(xì)胞的冷凍特別重要：例如克服第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞紡錘體微管解聚效應(yīng)。極高的冷卻速率可應(yīng)用于開(kāi)放式拉長(zhǎng)冷凍細(xì)管技術(shù)，也可通過(guò)使用冷凍環(huán)加以應(yīng)用。由于解凍后紡錘體仍能恢復(fù)正常的形態(tài)和功能，即使在慢速冷凍過(guò)程中被打斷仍可獲得較好的冷凍效果。

2　異位保護(hù)策略的影響

（1）保存材料種類(lèi)的選擇和采樣策略取決于保護(hù)計(jì)劃的目的。根據(jù)材料類(lèi)型、冷凍保存技術(shù)的可行性、成本和實(shí)際環(huán)境不同，所做的選擇也會(huì)不同。總的來(lái)說(shuō)，冷凍保存和相關(guān)的繁殖技術(shù)成本都很昂貴。異位保護(hù)廣泛發(fā)展的主要限制因素是收集成本昂貴，保存的物質(zhì)應(yīng)用有限。采樣、收集、冷凍、保存和遺傳材料利用的成本存在種間差異，最佳的策略取決于當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，技術(shù)能力和人工設(shè)備成本。Gandini和Pizzi查閱了有關(guān)保護(hù)成本的文獻(xiàn)，并得出了結(jié)論：有關(guān)異位保護(hù)成本的文獻(xiàn)有限，也不及時(shí)。Labroue計(jì)算了在歐洲4個(gè)國(guó)家建立精液保存庫(kù)的成本，每個(gè)品種大約30000歐元（Euro），單位劑量15歐元?？紤]到人工費(fèi)用、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和基礎(chǔ)費(fèi)用，假定冷凍能力在每天6次射精量上，在荷蘭進(jìn)行豬精液冷凍保存的成本估計(jì)為10歐元/劑量。精液由AI中心到貯存處的運(yùn)費(fèi)和精液收集的費(fèi)用未考慮。（2）荷蘭遺傳資源中心（CGN）的實(shí)驗(yàn)表明：不同物種精液收集和冷凍的成本，在單位劑量少于1歐元（牛）到多于20歐元（綿羊和家禽）不等。綿羊和家禽較高的成本是由單位劑量過(guò)高的操作，培訓(xùn)和冷凍成本以及缺乏這些物種AI基礎(chǔ)設(shè)施造成的。CGN得出了實(shí)驗(yàn)結(jié)論：在綿羊品種遺傳多樣性保護(hù)中，作為射精后精液收集和冷凍的一種備選，收集和冷凍淘汰公羊附睪精液是一種低投入高產(chǎn)出的方法。（3）物種間世代間隔和繁殖率的差異也可能影響保護(hù)計(jì)劃的制定。與其它物種相比，一些物種可以用便宜而簡(jiǎn)單的方法快速繁殖一代，例如在魚(yú)中用保存的精液通過(guò)回交再生一個(gè)滅絕的物種是可行的，這是因?yàn)轸~(yú)類(lèi)有較短的世代間隔和較高的年周轉(zhuǎn)量，相反，同樣的策略應(yīng)用于?；蝰R則不僅費(fèi)時(shí)還相當(dāng)昂貴，在這些物種中胚胎凍存比精液更適合。（4）胚胎收集和冷凍成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精液，但利用胚胎再生的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于利用精液（重復(fù)回交）再生的成本。雖然許多保護(hù)計(jì)劃只注重精液凍存，考慮到回交重建一個(gè)品種時(shí)線粒體DNA的丟失和時(shí)間上的滯后，如果僅出于品種保護(hù)的目的，那胚胎收集和凍存的作用就被低估了。在這種情況下，即使克隆的效率有相當(dāng)大的提高，體細(xì)胞的冷凍保存也無(wú)法替代胚胎冷凍保存。體細(xì)胞凍存的前期成本可能很低，但其線粒體DNA卻無(wú)法保存，并且隨后的生殖克隆在效率上無(wú)法與胚胎的凍存和移植相比。精液和卵母細(xì)胞的貯存在樣品采集和冷凍成本上具有成本優(yōu)勢(shì)，但是體外受精和卵收集的成本較高。估計(jì)用胚胎代替精液和卵母細(xì)胞的總體成本仍會(huì)偏高。（5）當(dāng)材料在冷凍/解凍后的存活率升高，妊娠率也增加時(shí)，繁殖足夠后代所需的基因庫(kù)遺傳材料就會(huì)減少，因而基因庫(kù)材料中采樣和冷凍上的成本就會(huì)降低。此外，如果遺傳上重要公畜精液的耐凍性能顯著提高時(shí)采樣成本就能進(jìn)一步降低。矛盾的是，冷凍保存的使用會(huì)造成遺傳多樣性的降低，但同時(shí)應(yīng)用于保護(hù)計(jì)劃時(shí)又是有利的，例如在荷蘭黑白花奶牛中結(jié)合使用遺傳評(píng)定、AI、冷凍精液和最近出現(xiàn)的其它繁殖技術(shù)后獲得了較高的遺傳進(jìn)展，促進(jìn)了荷蘭黑白花奶牛以地方奶牛品種的成本在世界范圍內(nèi)更大規(guī)模地利用，由此也降低了荷蘭黑白花奶牛有效（保種）群體的規(guī)模。作為一種副效應(yīng)，有關(guān)牛冷凍精液、AI和其它繁殖技術(shù)的知識(shí)最終對(duì)多個(gè)畜種的品種保護(hù)發(fā)揮了重要作用。

3　結(jié)論

（1）在以保護(hù)品種為目的的異位保護(hù)中，胚胎收集和冷凍保存的作用被低估了，應(yīng)給予更多關(guān)注。（2）冷凍保存技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)并將繼續(xù)提高保護(hù)計(jì)劃的效率和效能。（3）冷凍保存技術(shù)在其它物種上的發(fā)展有助于這些技術(shù)在欠發(fā)達(dá)物種上的發(fā)展。（4）保護(hù)計(jì)劃的決策者應(yīng)定期重新考慮目標(biāo)成本、技術(shù)可行性和實(shí)用性之間的平衡。

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S813.11文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

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泰安市科技發(fā)展計(jì)劃（201420774-20b）

2016-06-07）