中波紫外線局部照射治療大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的效果觀察

趙紅亮，陳敏瑋，冷向鋒，陳振雨，張維娜，刁婷婷

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266000)

中波紫外線局部照射治療大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的效果觀察

趙紅亮，陳敏瑋，冷向鋒，陳振雨，張維娜，刁婷婷

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266000)

目的 觀察中波紫外線局部照射治療大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的效果，并探討其機(jī)制。 方法 將30只大鼠隨機(jī)分為280 nm組、320 nm組和對照組，均建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的動物模型，280 nm組、320 nm組模型建立后即行280、320 nm人工紫外線照射1次，以后2次/d，每次4 min，持續(xù)7 d；對照組皮瓣制備后，不做任何處理。各組大鼠均于術(shù)后7 d用坐標(biāo)貼紙法測定皮瓣成活面積，計(jì)算皮瓣成活率；取各組大鼠皮瓣組織制作切片行免疫組織化學(xué)染色并測算VEGF陽性表達(dá)面積所百分比；用TUNEL法檢測各組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 280 nm組、320 nm組、對照組大鼠皮瓣術(shù)后7 d的成活率分別為62.38%±8.64%、54.49%±4.48%、39.61%±4.22%，皮瓣VEGF陽性表達(dá)面積所占百分比分別為91.39%±9.29%、70.46%±4.02%、34.97%±3.08%，細(xì)胞凋亡率分別為53.06%±5.64%、64.72%±3.73%、32.82%±1.72%。以上指標(biāo)280 nm組、320 nm組和對照組相比，P均<0.05；280 nm組、320 nm組相比，P<0.05。結(jié)論 中波紫外線局部照射治療大鼠皮瓣缺血再灌注損傷效果滿意，機(jī)制可能與其提高皮瓣組織VEGF表達(dá)有關(guān)。但中波紫外線局部照射會導(dǎo)致皮瓣細(xì)胞凋亡率升高，紫外線波長較短者細(xì)胞凋亡程度較輕。

中波紫外線;皮瓣;缺血再灌注損傷；血管內(nèi)皮生長因子；細(xì)胞凋亡

皮瓣移植過程中常需要經(jīng)過較長時(shí)間的缺血缺氧期，當(dāng)缺血再灌注時(shí)會發(fā)生缺血再灌注損傷，影響皮瓣成活。文獻(xiàn)報(bào)道，中波紫外線(波長280～320 nm)照射后，可以刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，一方面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)從而抑制相關(guān)炎性浸潤、改善局部微環(huán)境，另一方面促進(jìn)毛細(xì)血管的生成[1～4]。本研究觀察了中波紫外線局部照射治療大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的效果，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。PBS為美國Gibco公司產(chǎn)品，4%多聚甲醛、無水乙醇為上海浩然生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，VEGF免疫組化試劑盒、PV6000、DAB、TUNEL檢測液購自青島宏達(dá)通生物技術(shù)有限公司。280 nm和320 nm波長人工紫外線燈為青島紫元光電有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及皮瓣缺血再灌注損傷模型建立、紫外線照射方法 將30只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成280 nm組、320 nm組和對照組，各10只，術(shù)前禁食1 d，參考Petry和Worthamnde的方法[5]設(shè)計(jì)大鼠腹部皮瓣。均選用以腹壁淺血管為蒂的3 cm×6 cm大小的島狀皮瓣，用10%Na2S將腹部皮瓣區(qū)脫毛備用，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射行全身麻醉，并常規(guī)消毒后掀起皮瓣，皮瓣組織層次達(dá)皮下內(nèi)膜層并充分游離腹壁淺血管至其在股動靜脈的發(fā)出點(diǎn)，游離發(fā)出點(diǎn)附近的股動靜脈，置動脈夾，4-0絲線原位縫合皮瓣，6～8 h后打開縫線，取出動脈夾后原位縫合。針刺有出血，提示皮瓣缺血再灌注模型建造成功。280 nm組和320 nm組分別用280 nm和320 nm人工紫外線燈進(jìn)行照射，術(shù)后當(dāng)天照射1次，以后2次/d，每次4 min；對照組皮瓣缺血再灌注模型制作完成后，不作任何處理。

1.3 皮瓣外觀觀察及成活率測算 術(shù)后每天觀察各組大鼠皮瓣的顏色、毛發(fā)生長、壞死范圍及針刺出血情況等，術(shù)后7 d用坐標(biāo)貼紙法測定皮瓣成活面積，計(jì)算皮瓣成活率。皮瓣成活率=成活面積/設(shè)計(jì)面積×100%。

1.4 皮瓣組織VEGF檢測 取各組大鼠相同位置皮瓣下組織，4%多聚甲醛固定24 h，蒸餾水浸泡4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋成石蠟，切成厚度5 μm切片，采用二步法行免疫組化染色。所用試劑盒購自青島宏達(dá)通生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。每例標(biāo)本選取10個高表達(dá)視野并拍攝圖像，用Image Pro6.0 軟件測算每個隨機(jī)選擇的視野VEGF陽性染色面積所占百分比。

1.5 皮瓣組織細(xì)胞凋亡率測算 取各組大鼠相同位置皮瓣組織切片常規(guī)脫蠟、水化后，加入TUNEL反應(yīng)混合液(購自青島宏達(dá)通生物技術(shù)有限公司)，嚴(yán)格按照TUNEL說明書進(jìn)行具體操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染，封片待鏡檢。根據(jù)陽性凋亡細(xì)胞分布情況，切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個陽性視野，每個視野記數(shù)300個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率=5個視野凋亡細(xì)胞總數(shù)/1 500×100%)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠皮瓣外觀及成活率比較 術(shù)后第3天，280 nm組大鼠皮瓣邊緣處出現(xiàn)少許不規(guī)則的暗灰色硬痂區(qū)，隨時(shí)間推移，未見明顯范圍進(jìn)行性擴(kuò)大；對照組和320 nm組大鼠皮瓣邊緣處出現(xiàn)不同大小的片狀暗紅色或灰褐色硬痂區(qū)，且皮膚紋理變淺，硬痂區(qū)針刺出血實(shí)驗(yàn)陰性。術(shù)后7 d，暗色硬痂及壞死范圍增大，皮瓣的壞死區(qū)域與成活區(qū)域邊界較明顯，且成活區(qū)組織未見明顯異常增厚。術(shù)后7 d，處死大鼠，在切取標(biāo)本皮瓣組織過程中，280 nm組和320 nm組大鼠皮瓣區(qū)域出血情況比對照組明顯多。術(shù)后7 d，280 nm組、320 nm組、對照組大鼠皮瓣成活率為62.38%±8.64%、54.49%±4.48%、39.61%±4.22%。280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣成活率和對照組相比，P均<0.05；280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣成活率相比，P<0.05。

2.2 三組大鼠皮瓣VEGF表達(dá)比較 280 nm組、320 nm組、對照組VEGF陽性表達(dá)面積所百分比分別為91.39%±9.29%、70.46%±4.02%、34.97%±3.08%。280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣VEGF陽性表達(dá)面積所百分比和對照組相比，P均<0.05；280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣VEGF陽性表達(dá)面積所百分比相比，P<0.05。

2.3 三組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率比較 280 nm組、320 nm組、對照組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率分別為53.06%±5.64%、64.72%±3.73%、32.82%±1.72%。280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率和對照組相比，P均<0.05；280 nm組、320 nm組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率相比，P<0.05。

3 討論

中波紫外線可以穿透病毒外殼、真菌、孢子和其他微生物的細(xì)胞壁，破壞DNA或RNA，摧毀核酸復(fù)制能力或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到殺菌消炎的作用，且因其穿透性低僅可引起皮膚黏膜微熱的感覺，不會引起皮膚黏膜紅斑反應(yīng)及色素沉著，也不會明確誘發(fā)日光皮炎和皮膚癌[6～8]。中波紫外線照射皮膚后，作用于角質(zhì)形成細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中主要是VEGF，其對促進(jìn)血管生成和組織成活起主要作用[4,9,10]。正常的皮膚免疫系統(tǒng)(SIS)包括細(xì)胞和體液兩部分，與體內(nèi)其它免疫組織相互作用，共同維持皮膚微環(huán)境和軀體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[11,12],而其中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)作為最主要組成細(xì)胞，不僅有結(jié)構(gòu)支撐作用，更是SIS的重要組成部分，其在紫外線照射后可分泌IL-1β、IL-6、-IFN-γ、G-CSF、VEGF、MIP-1α、TNF-α以及IL-20等多種細(xì)胞因子[1～3]。另外中波紫外線可通過調(diào)控多種黏附分子及生長因子受體的表達(dá)和功能從而使朗格漢斯細(xì)胞表面的分子及角化細(xì)胞角化細(xì)胞分泌的細(xì)胞黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)減少，進(jìn)一步影響了T細(xì)胞的活化與抗原識別[13,14]。

本研究結(jié)果顯示，采用280 nm、320 nm中波紫外線局部照射的兩組大鼠皮瓣存活率高于對照組，且皮瓣VEGF表達(dá)高于對照組，表明280 nm和320 nm中波紫外線均能夠提高大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷后的成活率，這一效果可能與中波紫外線局部照射促進(jìn)皮瓣VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)皮瓣血管新生有關(guān)。280 nm組大鼠皮瓣成活率和VEGF陽性表達(dá)面積所百分比高于320 nm組，提示波長280 nm中波紫外線促進(jìn)皮瓣成活和VEGF表達(dá)的效果比波長320 nm者好。

本研究結(jié)果顯示，采用280 nm、320 nm中波紫外線局部照射的兩組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率均高于對照組，表明中波紫外線局部照射也會對皮瓣產(chǎn)生一定的損害[15～18]，280 nm組大鼠皮瓣細(xì)胞凋亡率低于320 nm，表明280 nm中波紫外線局部照射導(dǎo)致的皮瓣細(xì)胞凋亡程度低于320 nm。

綜上所述，中波紫外線局部照射可以提高缺血再灌注損傷皮瓣成活率，其機(jī)制可能與其提高皮瓣組織VEGF表達(dá)有關(guān)。但中波紫外線局部照射會導(dǎo)致皮瓣細(xì)胞凋亡率升高，紫外線波長較短者細(xì)胞凋亡程度較輕。

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山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014HM113)。

陳振雨(E-mail: zhl_plastic@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.011

R622.1

A

1002-266X(2016)47-0038-03

2016-06-12)