Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為影響的研究進展

韓倫，趙琳

(1撫順市礦務局總醫(yī)院，遼寧撫順 113000；2中國醫(yī)科大學藥理學教研室)

?

Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為影響的研究進展

韓倫1，趙琳2

(1撫順市礦務局總醫(yī)院，遼寧撫順 113000；2中國醫(yī)科大學藥理學教研室)

核因子E2相關因子2(Nrf2)是細胞調(diào)節(jié)抗氧化應激反應的重要轉錄因子，Nrf2與其接頭蛋白Keap1是細胞抗氧化反應的中樞調(diào)節(jié)者。當體內(nèi)發(fā)生氧化應激反應時，Nrf2與錨定蛋白Keap1發(fā)生解聚，解聚后的Nrf2與抗氧化反應元件(ARE)相互作用，可增加ARE調(diào)控的Ⅱ相氧化還原代謝酶活性并上調(diào)抗氧化反應基因表達水平，從而增加細胞抵抗氧化應激的能力。近年來相關領域研究結果發(fā)現(xiàn)Nrf2-Keap1在惡性腫瘤表達明顯增加，Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤發(fā)生、進展、遷移以及化療敏感等方面發(fā)揮重要作用，現(xiàn)將其研究進展綜述如下。

核因子E2相關因子2；錨定蛋白Keap1；信號通路；腫瘤；生物學行為

近年來隨著環(huán)境污染的加劇、人們飲食結構的改變以及遺傳等內(nèi)在因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率呈逐年升高趨勢。腫瘤相關基因信號通路成為研究熱點。前期的研究結果提示，核因子E2相關因子2(Nrf2)及其接頭蛋白Keap1是細胞抗氧化反應的中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤發(fā)生、進展、遷移以及化療敏感等方面發(fā)揮重要作用[1]。本文就Nrf2-Keap1信號通路基本結構與功能及其對腫瘤的生物學行為、放化療敏感性影響的研究進展作一綜述。

1 Nrf2-Keap1信號通路的基本結構與功能

1.1 Nrf2的基本結構與功能 Nrf2分子量為66～68 kD，機體各種組織細胞中均可見Nrf2表達。Nrf2蛋白質結構中包含1個基本的亮氨酸結構域，在人體表達中，Nrf2基因包含重要的6個活性功能區(qū)域，Neh1～6。Neh1功能區(qū)包含1個可與小Maf蛋白形成異二聚體的拉鏈結構bZIP，bZIP與Maf形成的異二聚體幫助Nrf2識別抗氧化反應元件(ARE)上特定DNA序列并與之結合，繼而達到上調(diào)下游目的靶基因轉錄水平目的。Neh2功能區(qū)與細胞質錨定蛋白Keap1相結合，Neh2上的ETGE缺失或突變會解除Nrf2和Keap1相互作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，當小鼠被敲除Nrf2基因后，多種基因(如環(huán)氧化水解酶、GCL、GSTs、HO-1、醌氧化還原)的表達水平都會降低，而上述基因能清除體內(nèi)氧自由基、生物毒性以及致癌物等，消除此類毒性物質可減少核酸及生物活性蛋白質的破壞，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。之前的研究結果顯示，Nrf2作為轉錄因子在抵抗細胞對抗外來異物和減輕氧化損傷中發(fā)揮重要作用[2]。Nrf2表達水平下降或缺失，會導致細胞對應激源敏感性升高；而細胞敏感性升高與癌癥進展、細胞凋亡以及炎癥修復時間延長等病理過程密切相關。

1.2 Nrf2的轉錄活化 Nrf2蛋白Neh4和Neh5功能區(qū)的第494位、511位及545和554位之間的氨基酸殘基具有細胞核信號傳遞和雙向核轉位調(diào)節(jié)功能。Neh4功能區(qū)包含一個轉錄連接器基序結合序列，可調(diào)節(jié)轉錄[3]。Neh5功能區(qū)與p45NF-E2結構上高度相似，可與CREB結合蛋白(CBP)相互作用。在所有家族成員中，Nrf2對目的基因的轉錄調(diào)節(jié)功能最強，可將靶基因轉錄活性提高100倍左右，其強效上調(diào)轉錄能力可能與Neh4-CBP和Neh5-CBP的協(xié)同作用相關[4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2結構與生物學活性的穩(wěn)態(tài)，與Keap1參與Nrf2泛素化作用相關，C273及C288兩個半胱氨酸位點在泛素化過程中發(fā)揮關鍵作用。

降解決定子(degrons結構)通常由氨基酸序列和(或)一個特別的蛋白質構象結合而成，降解決定子參與泛素化依賴蛋白酶介導的蛋白降解過程的關鍵反應步驟：E3泛素化連接酶必須先對降解決定子識別并結合相互作用。Nrf2的降解決定子是位于Neh2區(qū)的絲氨酸殘基，正常生理狀態(tài)下，Neh2區(qū)的降解決定子與E3泛素化連接酶復合物Keapl結合，呈非活化的降解狀態(tài)。氧化應激發(fā)生時，降解決定子因磷酸化而發(fā)生構象改變，泛素化依賴蛋白酶對Nrf2的識別能力減弱，結合及復合物形成減少，Nrf2降解減少，其轉錄調(diào)節(jié)活性相應增強。Nrf2泛素化調(diào)節(jié)機制與P53穩(wěn)定機制相似。正常生理狀態(tài)下，P53與Mdm2蛋白-E3連接酶結合成為泛素化依賴的降解蛋白酶作用的目標底物，表達水平降低，呈非活化狀態(tài)。應激反應及核酸損傷修復過程中，P53蛋白Ser-20位點發(fā)生磷酸化，P53與Mdm2的相互作用減弱，從而P53降解減少，穩(wěn)定性及生物學活性升高。以往研究表明，蛋白激酶C(PKC)家族中的眾多成員可使Nrf2發(fā)生磷酸化，作用位點在Nrf2的Ser-40[6]。

1.3 Keap1的基本結構與功能 Keap1是相對分子量為69 kD的蛋白質，Keap1蛋白質與果蠅肌動蛋白Kelch在結構上具有相似性而得名。Keap1蛋白DGR功能區(qū)包含6個雙甘氨酸重復序列，DGR功能區(qū)負責結合Nrf2以及胞質內(nèi)肌動蛋白，進而發(fā)揮生物學功能[7]。生理條件下，Nrf2被Keap1局限在胞質中，外源氧化劑或親電試劑或氧化劑影響下，Nrf2與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，Nrf2轉移進入細胞核，結合Maf蛋白成異二聚體。Nrf2-Maf異二聚體協(xié)助識別并結合ARE，進而激活目標代謝酶并上調(diào)抗氧化應激基因轉錄水平，實現(xiàn)細胞抗氧化應激反應。氧化還原平衡后，Keap1穿梭至細胞核內(nèi)，將Nrf2協(xié)同轉運回到細胞質后降解Nrf2，此循環(huán)實現(xiàn)Nrf2-Keap1信號傳導通路[8]。

1.4 Nrf2-Keap1信號通路的調(diào)節(jié)機制 氧化應激反應的誘因有很多，主要包括外源性藥物、重金屬、氧化劑以及電離輻射等理化因素[9]。氧化應激反應產(chǎn)物活性氧和親核物質可誘發(fā)機體急、慢性炎癥、動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)病變、甚至惡性腫瘤等疾病。生理條件下，Nrf2與Keap1的結合定位于細胞質中，被活性氧和親核物質激活后，通過細胞外信號途徑，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)、PKC以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，致使Nrf2磷酸化而活化。Nrf2從Keap1中解離，進入細胞核內(nèi)，激活后的Nrf2進而達到基因轉錄調(diào)節(jié)的功能。Kobayashi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Keap1的IVR區(qū)可與CuB結合，成為E3泛素化連接酶復合物的一部分；同時Keap1本身就具備泛素化連接酶生理活性。生理狀態(tài)下，Keapl與Nrf2結合，局限表達于細胞質，Nrf2處于非游離及不斷降解的非活性狀態(tài)。Keapl蛋白C273和C288半胱氨酸位點被認為是結合Nrf2并限定其活性的分子基礎。C273和C288這兩個位點中任何一個發(fā)生突變，針對Nrf2蛋白質的泛素化作用即會消除。外源氧化反應誘導因子可作用于C273、C288位點，引發(fā)Keapl構象改變。與Nrf2的耦聯(lián)作用力減弱，對Nrf2的泛素化作用消除，故細胞裂解液中可見Nrf2含量增加、半衰期明顯延長。

1.5 Nrf2-Keap1信號通路與抗氧化系統(tǒng) 機體氧化應激反應誘發(fā)的異常蛋白質的聚集，可導致神經(jīng)退行性改變以及細胞損傷，目前研究證實Nrf2-Keap1信號通路在細胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應激的機制中的重要地位。Kwak等[11]發(fā)現(xiàn)編碼蛋白酶亞單位的基因是Nrf2-Keap1信號通路的下游靶基因，應用一種植物源性抗氧化劑處理肝臟組織，實驗結果顯示，處理后肝臟組織中抗氧化相關蛋白酶活性升高，而對照組Nrf2缺失小鼠無此現(xiàn)象，這一實驗結果可成為Nrf2參與蛋白酶亞單位基因調(diào)控的又一有力證據(jù)。這一結果初步揭示，Nrf2介導細胞抵抗氧化應激的作用機制主要是調(diào)控蛋白酶亞單位基因表達水平，活化蛋白酶，降解氧化應激引起的異常蛋白[12]。

2 Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤生物學行為的影響

2.1 Nrf2-Keap1信號通路與腫瘤的發(fā)生 目前的研究已證明，多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可見Nrf2基因表達水平的下降或無表達，是腫瘤易感性的一個重要的因素[13]。Nrf2蛋白對防止異源性破壞DNA而致癌發(fā)揮著重要的保護機制。Nrf2功能的誘導劑可作為阻斷劑，阻止致癌因子與靶目標基因相互作用，抑制致癌物的產(chǎn)生及活化，防止致癌因子與重要的生物大分子如核酸和蛋白質等相互作用。甲基汞這一公認的致癌物質可激活Nrf2，Nrf2的激活可以促進甲基汞進入細胞間隙排泄并降解。Morito等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，敲除Nrf2基因的小鼠血液中亞硝基胺濃度明顯增高，增加了小鼠發(fā)生惡性腫瘤的風險。Keap1-Nrf2調(diào)控系統(tǒng)中，Keap1對Nrf2的抑制對氧化還原Ⅱ相代謝酶的調(diào)節(jié)具有很重要的作用，氧化還原Ⅱ相代謝酶可以通過結合反應來減少過氧化物對機體的損害。敲除Keap1的小鼠，其血液內(nèi)的氧化還原Ⅱ相代謝酶含量明顯增高，大部分小鼠在出生3周后死亡，大部分小鼠死于食管和胃的過度角化。在同時敲除Nrf2基因的情況下，可逆轉Keap1敲除后所引起的發(fā)育缺陷出現(xiàn)，表明Keap1負性調(diào)控Nrf2是機體必須的。

2.2 Nrf2-Keap1信號通路與惡性腫瘤耐藥性 Yomamoto等[15]研究者最早發(fā)現(xiàn)Nrf2-Keap1信號通路在維持細胞氧化還原平衡，防御外源性有害物及致癌物過程中發(fā)揮重要作用。但近來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可通過降低腫瘤細胞化療敏感性起到腫瘤細胞保護作用，比如誘導耐藥的產(chǎn)生該信號通路的下游基因，如HMOX-1、GPx及Prx1等都與腫瘤細胞泵出藥物有關。該信號通路參與多藥耐藥蛋白(MRPI-2)的調(diào)節(jié)，而MRPI-2與多種惡性腫瘤的多藥耐藥性直接相關。此外，Nrf2還可與HO-1相互作用，引起細胞耐藥。目前Nrf2-Keap1信號通路在腫瘤耐藥中作用機制尚處于起步階段，但已有實驗證實，下調(diào)Nrf2表達后可提高多種惡性腫瘤細胞如乳腺癌細胞、結直腸癌細胞及肺癌細胞對相應化療藥物的敏感性[16]。在進一步的研究中檢測Nrf2下游相關蛋白的表達變化可為臨床診療提供新的藥敏及腫瘤標記物，為腫瘤藥物的耐藥逆轉劑的研發(fā)提供有力的理論基礎，提高腫瘤的化療敏感性，改善惡性腫瘤的預后。

2.3 Nrf2-Keap1信號通路與惡性腫瘤的預防 植物來源的強Nrf2的誘導劑包括萊菔硫烷、姜黃素、表兒茶素酯、白藜蘆醇、咖啡酸苯乙醋、咖啡醇和咖啡白、番茄紅素；一些合成的化學藥品如奧替普拉、CDDO及其衍生物CDDO-Im也是強Nrf2誘導劑。這些化學預防復合物發(fā)揮作用的機制涉及誘導Nrf2依賴的適應性，調(diào)節(jié)氧化還原Ⅱ相代謝酶水平、抗氧化和防止細胞隨后發(fā)展成腫瘤的運載體等[17]。

2.4 Nrf2-Keap1信號通路對腫瘤的保護作用 Nrf2-Keap1信號通路可同時保護正常細胞和腫瘤細胞免于氧化應激的破壞。多種腫瘤細胞系或組織標本中可檢測到Keap1基因突變或Keap1基因表達水平的異常下調(diào)，Keap1突變及表達異常可保護腫瘤細胞，促進其增殖進展，作用機制可能是Nrf2蛋白表達水平升高及其下游基因的轉錄激活。肺癌研究中可見肺腺癌患者的Keap1體細胞突變率增高，不能有效控制Nrf2的功能。Keap1功能缺失會導致Nrf2過度表達，促進惡性腫瘤生長[18]。

綜上所述，在未來腫瘤的個體化治療中，抑制Nrf2的活性與表達將成為極具潛力的治療方法。

[1] Takagi Y, Kobayashi M, Li L, et al. MafT, a new member of small Maf protein family in zebra fish[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(1):62-69.

[2] JinW, WangH, YanW, et al. Role of Nrf Zin Protection against traumat in brain injury in mice[J]. J Neurotrauma, 2009,26(l):131-139.

[3] Klaassen CD, Reisman SA. Nrf2 the resue: effects of the antioxidative/eletrophilic response on the liver[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010,244(1):57-65.

[4] Maher J, Yamamoto M. The rise of antioxidant signaling-the evolution and hormetic actions of Nrf2[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010,244(1)：4-15.

[5] Zhang DD, Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keap1. dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabi-hzation of nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(22)：8137-5151.

[6] Reddy NM, Qureshi W, Potteti H, et al. Regulation of mitochondrial functions by transcription factor NRF2[M]. New York：Springer, 2014: 27-50.

[7] Huang CS, Lii CK, Lin AH, et al. Protection by chrysin, apigenin, and luteolin against oxidative stress is mediated by the Nrf2-dependent up-regulation of heme oxygenase 1 and glutamate cysteine ligase in rat primary hepatocytes[J]. Archives of Toxicology, 2013, 87(1):167-178.

[8] Jaiswal AK, Kaspar JVV, Nitum SK. Nrf2：INrf2(Keap1)signaling in oxidative stress[J]. Free Radic Biol Med, 2009, 47(9):1304-1309.

[9] Tong KI, Katoh Y, Kusunoki H, et al. Keap 1 recruits Neh2 through binding to ETGE and DLG motifs: characterization of the two site molecular recognition model[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(8):2887-2900.

[10] Kobayashi A, Okawa MI, Okawa H, et al. Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3-based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2[J]. Mol Cell Biol, 2004,24(16):7130-7139.

[11] Kwak MK, Wakabayashi N. Greenlaw JL, et al. Antioxidants enhance mammalian proteasome expression through the Keap1-Nrf2 signaling pathway[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(23):8786-8794.

[12] Singh A, Misra V, Thimmulappa RK, et al. Dysfunetional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung caneer[J]. PLoS Med, 2006,3(10):e420.

[13] Zhang P, Singh A, Yegnasubramanian S, et al. Loss of Kelch-like ECH-associated protein 1 function in prostate cancer cells causes chemoresistance and radioresistance and promotes tumor growth[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9(2):336-346.

[14] Morito N, Yoh K, Ltoh K, et al. Nrf2 regulates the sensitivity of death receptor signals by affecting intracellular glutathione levels[J]. Oneogene, 2003,22(58):9275-9281.

[15] Yamamoto M, Koyama A. EPR imaging of reducing activityin Nrt2 transcriptional factor-deficient mice[J]. Free Radie Biol Med, 2003,34(10):1236-1242.

[16] Kweon MH, Adhami VM, Lee JS, et al. Constitutive overexpression of Nrf2-dependent heme oxygenase-1 in A549 cells contributes to resistance to apoptosis induced by epigallocatechin 3 -gallate[J]. J Biol Chem, 2006,281(44):33761-33772.

[17] Takahashi T, Sonobe M, Menju T, et al. Mutations in Keap1 are a potential prognostic factor in resected nonsmall cell lung cancer[J]. J Surg Oncol, 2010,101(6):500550.

[18] Konig J, Hartel M, Nies AT, et al. Expression and localization of human multidrug resistance protein (ABCC) family members in pancreatic carcinoma[J]. Int J Cancer, 2005,115(3):359-367.

遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃(LJ2015118Q)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.037

R73

A

1002-266X(2016)36-0103-03

2016-04-01)