副豬嗜血桿菌病診斷研究進展

張穎/天津市動物疫病預防控制中心

副豬嗜血桿菌病診斷研究進展

張穎/天津市動物疫病預防控制中心

副豬嗜血桿菌病又稱革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的豬的呼吸道傳染病，主要感染斷奶前后仔豬，引起豬多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎，已嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，因此早期診斷有助于控制好該病。

一、病原學檢測

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變進行細菌分離鑒定是副豬嗜血桿菌病的經(jīng)典診斷方法。然而該菌培養(yǎng)條件苛刻，生長過程需要額外的NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）。但往往在實際操作中發(fā)現(xiàn)，很難從患病動物中分離到HPS，尤其是經(jīng)抗生素治療后，其分離更加復雜。

二、血清學檢測

用于檢測副豬嗜血桿菌抗體的方法由補體結(jié)合試驗（CF）、間接血凝試驗（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。

1.補體結(jié)合試驗（CF）。過去國外以補體結(jié)合試驗為主，在急性病例的臨床經(jīng)過開始后大約1周出現(xiàn)循環(huán)CF抗體。Takahashi等采用補體結(jié)合試驗檢測二次免疫后19 d后陽性抗體滴度，但該實驗并未檢測不同血清型之間的交叉反應。由于補體結(jié)合試驗參與反應的成分多，影響因素復雜，操作因素復雜，已被其他方法取代。

2.間接血凝試驗（IHA）。將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關且有一定大小的不溶性顆粒的表面，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，與相應的抗體發(fā)生特異性凝集。魏子貢等將血清型4、5型分離菌株經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化紅細胞，建立HPS間接血凝試驗，其敏感性為瓊脂擴散試驗的16倍，對1 665份豬血清進行檢測，陽性率47.1%。

3.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。

ELISA方法是目前實驗室診斷中常用的方法，具有靈敏度高、穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點。建立該方法所選擇的抗原由莢膜多糖、滅活全菌體、超聲破碎抗原等。王艷等以副豬嗜血桿菌全菌體濃度為2.24×107CFU/孔作為包被抗原，建立了副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，經(jīng)檢測，14個發(fā)病豬場的100份血清抗體陽性率94%，明顯高于細菌分離鑒定結(jié)果。石碧等以該菌血清5型菌株的莢膜多糖作為抗原分別建立了間接血凝試驗（IHA）和間接ELISA兩種抗體檢測方法，其特異性良好，但ELISA敏感性是IHA的5～10倍。對320份臨床樣本進行檢測，IHA和ELISA陽性率分別40%和59%。劉娜等提取該菌的超聲波破碎抗原、全菌抗原作為包被抗原建立的兩種間接ELISA方法，對四川省和重慶市的4個豬場的162份血清進行檢測，并用間接血凝試驗作為對照，結(jié)果顯示，包被全菌抗原、超聲波破碎抗原建立的間接ELISA方法相對于間接血凝方法的符合率分別為98.15%和97.53%。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌血清5型分離株菌體上清作為包被抗原，對其反應條件進行優(yōu)化，建立間接ELISA方法，并對浙江地區(qū)6個豬場的200份血清進行檢測，以間接血凝作比對，其陽性率分別為21%、15%，敏感性明顯高于間接血凝試驗。馬福利等采用超聲裂解副豬嗜血桿菌分離株5型菌體上清作為包被抗原，初步建立副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA檢測方法。與商品化ELISA試劑盒進行比對，檢測結(jié)果基本一致。然而血清學檢測只能作為豬群是否感染過副豬嗜血桿菌的診斷依據(jù)，而不能作為診斷該病的依據(jù)，在臨床診斷中，除了觀察豬群臨床癥狀、病理變化，還需借助分子生物學技術進行確診。

三、分子生物學技術

隨著分子生物學研究的不斷深入，PCR診斷技術已廣泛用于各個領域。尹秀鳳等建立了快速、簡便、準確的PCR方法，擴增片段大小為822 bp，最小檢測量為1 080個Hps。與大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌無特異性反應。經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn)肺臟檢出率最高。張盼鋒等針對副豬嗜血桿菌16 s rRNA基因特異性PCR引物序列，合成一對PCR引物，建立相應的PCR檢測方法，結(jié)果顯示可檢測出濃度為2.8×103CFU/mL。萬世平等根據(jù)副豬嗜血桿菌16 s rRNA基因設計了一對引物， 通過最佳條件摸索，擴增出大小為821 bp的特異目的基因片段， 建立了快速檢測副豬嗜血桿菌的PCR方法。該方法最低檢出量達10-3ng， 且對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌等均無交叉反應。但常規(guī)PCR只能定性，而不能定量起始DNA模板的拷貝數(shù)，隨著熒光定量PCR技術的快速發(fā)展，該技術廣泛用于用于疾病的檢測。該技術靈敏度比普通PCR提高100倍，并能減少假陽性發(fā)生的幾率，并且由于不用電泳減少了污染、節(jié)省了時間、使檢測結(jié)果更為直觀。于江等根據(jù)infB基因序列建立基于SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果表明，該方法特異性強，穩(wěn)定性高，批間與批內(nèi)重復試驗變異系數(shù)均小于2.5%。李軍等根據(jù)16 s rRNA基因序列，建立快速定量檢測副豬嗜血桿菌的實時熒光PCR方法，結(jié)果表明，該方法最低檢測限為50拷貝/uL，特異性、重復性好，變異系數(shù)均小于2%。羅寶玉等根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因序列，建立TaqMan探針熒光PCR技術，檢測結(jié)果顯示，其靈敏度達1 ul 1.0×101拷貝的數(shù)量級，在對送檢的56份豬肉和12份血漿蛋白粉樣品進行檢測中顯示，該方法與細菌分離方法效果一致。

四、環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術最早是由日本學者Notomi于2000年提出的新的基因診斷技術，目前已有一些病原微生物成功利用LAMP檢測，該方法靈敏度高，反應時間短，無需特殊儀器，操作簡單，特別適合基層人員操作。朱杰儀等人根據(jù)GenBank上發(fā)表的不同血清型Hps的16S rRNA序列，針對其保守區(qū)域設計4條特異性引物，建立Hps環(huán)介導等溫擴增法，實驗表明，該方法在恒溫63℃條件下特異性強，敏感性是PCR的100倍。魏曉媛以OMP P2基因序列建立環(huán)介導等溫擴增方法進行檢測，結(jié)果顯示，LAMP最低檢測DNA量為0.2 pg/ uL。車勇良等根據(jù)副豬嗜血桿菌肽聚糖相關脂蛋白（PalA）基因序列建立該菌的可視化LAMP檢測方法，實驗表明，該方法在55℃水浴1h可高效擴增，反應結(jié)束后加入SYBR Green I可通過肉眼觀察結(jié)果，其對DNA核酸的最低檢測限為40fg，是常規(guī)PCR檢測最低限的100倍。但在實際操作中，由于其靈敏度高，以致開蓋后容易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。隨著分子生物學的發(fā)展，相信一些新型診斷方法會不斷問世以推廣應用，使人們能更快速、準確地診斷副豬嗜血桿菌病。

（略）