北川白山羊兩例肺炎支原體PCR檢測及藥敏實驗

王雪 李海全 肖香 李霞 黃宇 譚林/四川省北川羌族自治縣農(nóng)業(yè)局

北川白山羊兩例肺炎支原體PCR檢測及藥敏實驗

王雪 李海全 肖香 李霞 黃宇 譚林/四川省北川羌族自治縣農(nóng)業(yè)局

羊支原體性肺炎（Mycoplasma ovipneumoniae MO），在我國四川、甘肅等省區(qū)，從具有類似山羊傳染性胸膜肺炎癥狀和病理變化的綿羊和山羊中分離到本病原并經(jīng)過與國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Y98對型，鑒定為綿羊肺炎支原體。本病常呈地方性流行，在北川縣呈流行趨勢，影響到養(yǎng)羊業(yè)正常生產(chǎn)與發(fā)展。

2016年6月，北川縣某白山羊場未經(jīng)申報審批私自從山東省某羊場引進(jìn)1只波爾山羊種羊，引進(jìn)10天后，該場山羊陸續(xù)出現(xiàn)咳嗽、消瘦、流漿液性鼻漏等癥狀，后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，我中心技術(shù)人員到達(dá)現(xiàn)場后，病羊呼吸困難，眼險腫脹，剖檢2頭病羊，肺兩側(cè)對稱性肉變，呈淺粉灰色，肺間質(zhì)增生炎。胸腔有淡黃色積液，采集肺組織并做藥敏試驗，現(xiàn)報告如下：

一、材料與方法

1.樣品采集。采集疑似感染肺炎支原體的山羊肺組織各1份，冷凍保存，低溫運輸。

2.主要培養(yǎng)基。15%馬血清改良Hayfliek氏培養(yǎng)基，瓊脂0.7%的血清瓊脂培養(yǎng)基。

3.主要試劑。主要各藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

4.PCR檢測。

（1）PCR引物設(shè)計與合成。參照已發(fā)表的羊肺炎支原體和絲狀支原體保守序列設(shè)計引物并合成。

（2）肺組織中病原DNA的提取。采用Trizol法提取細(xì)菌總DNA。

（3）PCR擴增。采用25μl反應(yīng)體系。

（4）電流觀察結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。結(jié)果如圖1。

5.藥敏試驗。

（1）培養(yǎng)特性。

（2）染色鏡檢。取所分離細(xì)菌純化后進(jìn)行藥物敏實驗。藥物敏感性試驗參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)的藥敏紙片法進(jìn)行，選用β-內(nèi)酰胺類，氨基糖苷類，喹諾酮類，大環(huán)內(nèi)酯類，四環(huán)素類等33種藥敏紙片。結(jié)果見表1。

二、結(jié)果與分析

1.支原體感染的診斷主要依靠病原學(xué)檢測，支原體分離和培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是支原體分離培養(yǎng)是個復(fù)雜而漫長的過程。因為病料很容易受到其他支原體和雜菌的污染，兩份樣本中檢測出均為羊肺炎支原體陽性，絲狀支原體為陰性。

2.從藥敏試驗結(jié)果可見本文分離的菌株已經(jīng)產(chǎn)生了很強的耐藥性，該菌對利福平、SMZ+TMP、萬古霉素替卡西林/克拉維酸等藥物敏感，對喹諾酮類、氟苯尼考等常用治療支原體藥物不敏感。

圖1　羊肺炎支原體和絲狀支原體雙重PCR電泳圖

藥物種類藥物名稱判斷標(biāo)準(zhǔn)（單位：mm）敏感中敏耐藥羊菌株1羊菌株1 β-內(nèi)酰酶抑制劑阿莫西林/克拉維酸＞=1814-17＜=13中介（16）耐藥（12）氨芐西林/舒巴坦＞=1512-14＜=11敏感（17）敏感（20）替卡西林/克拉維酸＞=2015-19＜=14敏感（28）敏感（20）頭孢噻吩（先鋒Ⅰ）＞=1815-17＜=14耐藥（11）中介（15）頭孢拉定（先鋒Ⅵ）＞=1815-17＜=14耐藥（無）中介（16）頭孢吡肟＞=1815-17＜=14敏感（19）敏感（22）頭孢噻肟＞=1815-17＜=14耐藥（13）敏感（30）碳青霉烯類亞胺培南＞=1614-15＜=13敏感（21）敏感（19）頭孢類壁霉素（替考拉寧）＞=1411-13＜=10敏感（18）敏感（21）萬古霉素＞=1715-16＜=14敏感（22）敏感（28）桿菌肽＞=139-12＜=8耐藥（無）耐藥（無）氨基糖苷類丁胺卡那＞=1715-16＜=14敏感（20）敏感（25）磺胺類磺胺＞=1713-16＜=12耐藥（無）中介（15）SMZ+TMP＞=2414-23＜=13敏感（31）敏感（29）截短側(cè)耳類氟苯尼考＞=1813-17＜=12耐藥（11）中介（14）利福霉素類利福平＞=2017-19＜=16敏感（31）敏感（32）糖肽類

3.對于本病的預(yù)防，主要的還是加強飼養(yǎng)管理，定期對圈舍徹底消毒，不能從疫區(qū)引進(jìn)羊只，防止引入或遷出病羊帶菌者，新引進(jìn)羊必須隔離檢疫1個月以上，確認(rèn)健康時方可混入大群。流行地區(qū)可以全群注射山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁疫苗， 6月齡以上每羊5 ml，6月齡以下每羊3 ml，肌肉注射，1年1次。發(fā)病羊群應(yīng)進(jìn)行封鎖，對病羊、可疑病羊和假定健康羊分群隔離和治療對被污染的羊舍、場地、飼管用具和病羊的尸體、糞便等應(yīng)進(jìn)行徹底消毒或無害處理。

（略）

圖2?。悍伍g質(zhì)增生炎

圖3?。悍蝺蓚?cè)對稱性肉變

圖4?。?病羊流漿液性鼻漏

圖5?。盒厍挥械S色積液