重組偽狂犬病病毒疫苗的研究進展

李佳琪

(新鄉(xiāng)市人民公園，河南新鄉(xiāng) 453000)

重組偽狂犬病病毒疫苗的研究進展

李佳琪

(新鄉(xiāng)市人民公園，河南新鄉(xiāng) 453000)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對偽狂犬病病毒的分子學(xué)特征研究也逐步深入，根據(jù)基因工程原理對偽狂犬病病毒的基因組進行改造，從而構(gòu)建了多種含有不同外源基因的重組偽狂犬病病毒疫苗。這種疫苗不僅可以為豬的偽狂犬病提供保護，同時還可以產(chǎn)生針對外源保護性抗原的特異性免疫反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者在本文中系統(tǒng)地對近些年所報告的多種重組偽狂犬病病毒疫苗的安全性和免疫原性就行了綜述，以期為偽狂犬病病毒新的基因工程疫苗的研制提供一定的參考。

偽狂犬病病毒；基因重組；重組活載體疫苗

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，它可以引起豬的偽狂犬?。≒seudorabies，PR），嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。近年來，以PRV為載體的重組活疫苗發(fā)展迅速。

1 偽狂犬病病毒的基因組特征

PRV基因組是線性雙鏈DNA（dsDNA），大小約為145kb，G+C含量高達74%，包含至少70多個基因，這些基因分成4個部分：獨特的長區(qū)段（UL）、獨特的短區(qū)段（US）、以及位于US兩側(cè)的內(nèi)部重復(fù)序列（IR）和末端反向重復(fù)序列（TR）[1]。PRV基因組中已知與毒力有關(guān)的基因如下：US區(qū)的US3、US4、US6、US7和US8；UL區(qū)的UL10、UL13、UL21、UL23（TK）、UL39/40、UL44、UL50。這些基因共同控制著PRV的毒力，缺失其中一個或者多個與病毒復(fù)制無關(guān)的毒力基因便可以減弱PRV的毒力。

2 與構(gòu)建重組偽狂犬病病毒有關(guān)的基因

以PRV為載體的重組疫苗，一方面可以選擇缺失與病毒毒力有關(guān)的基因如胸苷激酶（TK）、蛋白激酶（PK）、核苷還原酶（RR）和脫氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase），另一方面也可以缺失一些具有免疫原性的非必需糖蛋白如gE，gG，gD等。

UL23基因編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白胸苷激酶（TK），主要功能是催化脫氧胸苷或嘧啶磷酸化為dTTP，雖然TK基因不是PRV復(fù)制所必需的，但是Berns[2]等發(fā)現(xiàn)TK基因是PRV的一個主要毒力基因，與病毒在動物體內(nèi)的潛伏感染以及神經(jīng)節(jié)中的復(fù)制有很大關(guān)系。因此UL23的缺失對PRV的毒力減弱比較明顯，第一代PRV基因缺失疫苗就是通過缺失TK毒力基因獲得的疫苗。

US8基因編碼gE蛋白，它屬于典型的I型蛋白，主要促進病毒通過神經(jīng)元進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并在其中轉(zhuǎn)運擴散，同時也加速病毒在感染細(xì)胞之間的擴散、融合以及成熟病毒粒子的釋放[1]。US7基因編碼的gI蛋白與gE蛋白通過非共價鍵形成異源二聚體，構(gòu)成病毒囊膜蛋白的一部分，與病毒的毒力密切相關(guān)。

US4基因編碼病毒復(fù)制的非必需糖蛋白gG，這是目前發(fā)現(xiàn)的唯一分泌到病毒外的糖蛋白，可以刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。gG蛋白不存在成熟的病毒粒子中，由病毒的晚期基因編碼，能夠影響病毒在細(xì)胞間的擴散或感染細(xì)胞的凋亡[3]。gG基因在豬感染野毒株和疫苗缺失株的鑒別診斷中具有重要意義。

隨著國內(nèi)外學(xué)者對PRV各基因功能研究的深入，特別是對基因UL23，US8/US7，US4等基因的研究，為PRV重組活載體疫苗的設(shè)計和構(gòu)建打下了堅實的理論基礎(chǔ)。

3 重組偽狂犬病病毒疫苗的研究

國內(nèi)外對重組的PRV疫苗的研究主要集中在PRV與豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）等病毒的重組。

3.1 重組的CSFV/PRV的研究

Zijl[4]等最早實現(xiàn)了將病原的保護性抗原基因在偽狂犬病病毒中的表達，并將豬瘟病毒囊膜蛋白基因E1 融合到缺失了TK、gE、11K基因的PRV783-gG 啟動子的下游，構(gòu)建了表達E1 的重組偽狂犬病毒；動物試驗顯示，該重組病毒在免疫豬體內(nèi)均能產(chǎn)生對HCV和PRV 高滴度中和抗體，并可以保護免疫豬免受PRV和HCV 的強毒攻擊。徐志文[5]等以 PRV 三基因缺失疫苗 SA215 株為載體，通過同源重組和蝕斑篩選的辦法獲得能穩(wěn)定表達CSFV E2 基因的重組毒PRV SA215（A）株，接種豬能夠同時抵抗PRV和CSFV強度的攻擊。J.L.Lei[6]等以現(xiàn)地流行的PRV-TJ變異株為載體構(gòu)建了能夠表達CSFV E2蛋白的重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/ TK-E2，并在豬體上評價了其安全性和免疫原性，結(jié)果顯示，以不同劑量的重組病毒來免疫實驗豬，實驗組均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，且在攻毒后豬支的排毒量也顯著降低，能同時保護免疫豬免受CSFV和PRV-TJ毒株致死劑量的攻擊。

3.2 重組的PPV/PRV的研究

呂建強[7]等將PPV-VP2基因插入到PRV基因組中，構(gòu)建了表達PPV-VP2基因的重組病毒 PRV TK-/gG-/ VP2+，并且表達蛋白能與 PPV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，增殖特性類似親本株。Q.Hong[8]等等利用 PRV TK-/gE-/LacZ+缺失株，構(gòu)建了能夠表達FMDV 衣殼蛋白前體 P1-2A 和 PPV VP2蛋白的重組 PRV 株，免疫的小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對PPV、FMDV、PRV的特異性抗體和中和抗體，證實該疫苗株對小鼠的安全性和保護性較好。

3.3 重組的FDMV/PRV的研究

X.M.Li[9]等將FMDV的P1基因的表達盒成功克隆至PRV 弱毒疫苗株（TK-/gG-/LacZ+）的基因組中，成功構(gòu)建了能夠表達FMDV結(jié)構(gòu)蛋白P1的重組毒PRV-P1，免疫的動物體內(nèi)能夠同時產(chǎn)生針對PRV和FMDV的較高水平的中和抗體以及增強CTL對FMDV的應(yīng)答能力，攻毒后能夠保護免疫豬抵抗強毒的攻擊。Y.N.He[10]等將包含F(xiàn)MDV潛在的 6個B細(xì)胞表位和2個T細(xì)胞表位表達盒的多價抗原決定簇基因“FHG”克隆到重組病毒PRV-TK-/gG-/P1+的gE/gI基因位點產(chǎn)生新的重組病毒FHG/P1/PRV，它的免疫原性和只含有FMDV P1蛋白的重組毒相比，免疫豬體內(nèi)能夠產(chǎn)生相似水平的PRV特異性中和抗體，但是增強了對FMDV的特異性中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，重要的是免疫動物體內(nèi)檢測不到gE和gG的特異性抗體，使該重組毒具有了很大了開發(fā)價值和應(yīng)用潛力。

4 小結(jié)與展望

隨著國內(nèi)外學(xué)者對PRV研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有很多其它病毒載體不具備的優(yōu)點：外源基因容量大、免疫持續(xù)期長、宿主范圍廣、成本低、安全性好、不感染人。目前絕大數(shù)研究都是以PRV弱毒疫苗為載體，將外源保護性抗原基因插入到PRV復(fù)制非必需基因處，通過同源重組和蝕斑篩選的方法獲得能夠穩(wěn)定表達外源基因的重組毒株。免疫接種易感動物后，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生同時針對兩種病原的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，由于PRV病毒載體的基因容量比較大，可同時插入多個外源基因，從而實現(xiàn)了免疫一種疫苗可防治多種疾病的目的。因此對這種多價活載體疫苗的研究被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景和開發(fā)價值的方向之一。但是我們必需理性的認(rèn)識到一個成功且實用的重組活載體疫苗的構(gòu)

建，并不僅僅是依據(jù)基因工程原理和分子生物技術(shù)即可完成的，還必需考慮到插入位點、保護性抗原基因以及免疫保護機制等問題。PRV載體應(yīng)用中仍然存在一些瓶頸問題沒有解決，如一個好的載體系統(tǒng)首先要具備強的啟動子以突破目前外源基因表達水平偏低的難關(guān)；報告基因在動物體內(nèi)的表達可能影響目的抗原的免疫原性；載體免疫和目的抗原免疫之間的競爭，因此為了讓極具潛力的病毒活載體疫苗早日得到廣泛的應(yīng)用，我們還需要對PRV進行更深入、更全面的機制方面的研究。

[1] Pomeranz L E，Reynolds A E，Hengartner C J. Molecular biology of pseudorabies virus：impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2005，69（3）：462-500.

[2] Berns A，van den Ouweland A，Quint W，et al. Presence of markers for virulence in the unique short region or repeat region or both of pseudorabies hybrid viruses[J].J Virol，1985，53（1）：89-93.

[3] Nakamichi K，Ohara K，Kuroki D，et al. Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is required for viral growth by cell-to-cell infection[J]. Virus Res，2000，68（2）：175-181.

[4] van Zijl M，Wensvoort G，de Kluyver E，et al. Live attenuated pseudorabies virus expressing envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus protects swine against both pseudorabies and hog cholera[J]. J Virol，1991，65（5）：2761-2765.

[5] 徐志文.豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[6] Lei J L，Xia S L，Wang Y，et al. Safety and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant expressing the E2 protein of classical swine fever virus in pigs[J]. Immunol Lett，2016，（174）：63-71.

[7] 呂建強，陳煥春，趙俊龍，等.表達豬細(xì)小病毒 VP2 基因的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特征研究[J].病毒學(xué)報，2004，20（2）：133-137.

[8] Hong Q，Qian P，Li X M，et al. A recombinant pseudorabies virus co-expressing capsid proteins precursor P1-2A of FMDV and VP2 protein of porcine parvovirus：a trivalent vaccine candidate[J]. Biotechnol Lett，2007，29（11）：1677-1683.

[9] Li X，Liu R，Tang H，et al. Induction of protective immunity in swine by immunization with live attenuated recombinant pseudorabies virus expressing the capsid precursor encoding regions of foot-andmouth disease virus[J]. Vaccine 2008，26（22）：2714-2722.