大孔吸附樹脂富集純化桃兒七中的鬼臼毒素

王謹(jǐn)慧， 靳子明， 李茂星

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

?

大孔吸附樹脂富集純化桃兒七中的鬼臼毒素

王謹(jǐn)慧1， 靳子明1， 李茂星2*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730020；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

摘要：目的 建立桃兒七中鬼臼毒素的大孔吸附樹脂富集純化工藝。方法 HPLC法測定樣品中鬼臼毒素的含有量，比較12種不同廠家、型號(hào)的大孔樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素的吸附與解吸附條件，優(yōu)選最佳的純化工藝。結(jié)果 HPD-100型大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素具有良好的吸附能力，30％乙醇能大量洗脫除去雜質(zhì)，60％乙醇能解吸附鬼臼毒素，95％乙醇能再生大孔吸附樹脂柱。富集后，鬼臼毒素的含有量達(dá)到28.46％，遠(yuǎn)高于水提取物中的1.58％。結(jié)論 采用HPD-100型大孔吸附樹脂能從桃兒七水提取物中快速富集提取鬼臼毒素，而且樹脂重復(fù)利用度高。

關(guān)鍵詞：桃兒七；鬼臼毒素；大孔吸附樹脂；富集純化

鬼臼毒素（Podophy11otoxin）及其衍生物鬼臼乙叉苷（Etoposide，VP-16）和鬼臼噻吩苷（Teniposide，VM-26）具有良好的抗癌活性，臨床廣泛用于治療淋巴瘤、急性白血病、睪丸癌、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌和腦癌等［1-2］。鬼臼毒素主要來源于小檗科桃兒七屬植物桃兒七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying的果實(shí)、根及根狀莖［3］，隨著鬼臼毒素需求量的增加，對(duì)其提取和合成等研究顯得尤為重要。目前，對(duì)鬼臼毒素的提取主要有化學(xué)提取法和柱層析法［4-5］，但都存在化學(xué)試劑大量浪費(fèi)、安全性差、效率低和污染嚴(yán)重等問題。

大孔吸附樹脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生簡單、解吸方便等優(yōu)點(diǎn)［6］，已經(jīng)用于植物中黃酮［7］、皂苷［8］、二萜［9］、生物堿［10］等活性單體的分離純化，但應(yīng)用其分離純化木脂素類成分，特別是鬼臼毒素（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過選用大孔吸附樹脂，從桃兒七中分離純化鬼臼毒素，在有效成分損失較小的情況下很好地除去了雜質(zhì)，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)率和質(zhì)量，并具有簡單、無毒和環(huán)境友好等特點(diǎn)。

圖1　鬼臼毒素（Podophyllotoxin）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀，包括600型二元控制系統(tǒng)、996型二極管陣列紫外檢測器（美國Waters公司）；BP210S電子天平（德國Sartorius公司）；LSA40、LSA5B型大孔吸附樹脂（西安藍(lán)曉科技有限公司）；DA201、D101、DM301、AB8型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司）；YWD03F4、YWD09D、YWD07D型大孔吸附樹脂（滄州遠(yuǎn)威化工有限公司）；HPD100、HPD400、HPD600型大孔吸附樹脂（滄州寶恩化工有限公司）。桃兒七藥材為市售，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為桃兒七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying。鬼臼毒素（Podophy11otoxin）對(duì)照品由蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院田暄教授饋贈(zèng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 桃兒七水提物的制備 取桃兒七根及根狀莖250 g，粉碎至20目，加入蒸餾水1 500 mL，煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，放冷，過濾，即得。

2.2 鬼臼毒素含有量的測定［11-14］采用Waters高效液相色譜儀分析；流動(dòng)相為45％甲醇；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為292 nm；數(shù)據(jù)采用Mi11enium 2.10版軟件處理；Symmetry反向C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。

2.3 靜態(tài)吸附測定 取12種已處理好的樹脂，每種5 mL，加入250 mL小口瓶中，每瓶加入樣品液80 mL和蒸餾水20 mL，25℃下靜置18 h，期間振搖10次。HPLC法測定各大孔吸附樹脂對(duì)鬼臼毒素的吸附量。將吸收度數(shù)值代入回歸方程，求得剩余含有量，重復(fù)3次。每mL樹脂靜態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂，結(jié)果見表1。

表1　12種大孔吸附樹脂靜、動(dòng)態(tài)吸附量的考察

2.4 動(dòng)態(tài)吸附測定 取12種已處理好的樹脂，每種2 mL，加入玻璃層析柱中，20 mL樣品液以3 mL/min的體積流量反復(fù)上樣3次，100 mL蒸餾水洗脫，收集洗脫液。HPLC法測定其中鬼臼毒素的含有量，即為未被樹脂吸附的鬼臼毒素量，重復(fù)3次。被樹脂吸附的鬼臼毒素量=上樣總鬼臼毒素量-未被樹脂吸附的鬼臼毒素量；每mL樹脂動(dòng)態(tài)吸附比=被樹脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL樹脂，結(jié)果見表1。

由表可知，各型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提物中的鬼臼毒素成分都有不同程度的吸附，其中HPD-100型的動(dòng)態(tài)吸附性能最好，LSA-40最差，但差距不大。

2.5 HPD100洗脫體系研究

2.5.1 洗脫溶劑的選擇 考慮到在富集純化過程中，動(dòng)態(tài)吸附能力更加重要，因此根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，選取HPD-100型樹脂繼續(xù)研究。取已處理好的HPD100樹脂100 mL，加入玻璃層析柱中，以含1 000 mL樣品液的桃兒七水提物上樣，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（0％、20％、30％、40％、50％、60％、95％）以1.5 BV/h體積流量解吸附洗脫，然后真空干燥，稱重，重復(fù)3次。HPLC法比較各溶液中的成分，見圖2。并測定鬼臼毒素的含有量，見表2。

1.鬼臼毒素A.標(biāo)準(zhǔn)品溶液 B.上樣水溶液 C.水洗脫液 D.20％乙醇洗脫液 E.30％乙醇洗脫液 F.40％乙醇洗脫液G.50％乙醇洗脫液 H.60％乙醇洗脫液 I.95％乙醇洗脫液圖2　各溶液中的HPLC成分分析

表2　動(dòng)態(tài)解吸附過程中不同濃度乙醇的洗脫能力

由此可知，以HPD100為吸附劑時(shí)，水、10％、20％乙醇只能將水溶性成分洗脫下來；30％乙醇的洗脫液中可見很少量的鬼臼毒素；從40％乙醇開始，大量鬼臼毒素被洗脫下來；到60％乙醇時(shí)，可幾乎將鬼臼毒素全部洗脫下來。綜上所述，可用30％乙醇在不損失太多目標(biāo)物的前提下，大量洗脫除去雜質(zhì)，然后用60％乙醇對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行解吸附，最后用95％乙醇再生大孔吸附樹脂柱。

2.5.2 洗脫體積及洗脫曲線研究 取已處理好的HPD100樹脂20 mL，加入玻璃層析柱中，以400 mL桃兒七水提取樣品液上樣，蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性，計(jì)算洗脫體積。30％乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量洗脫，HPLC法動(dòng)態(tài)檢測至其中鬼臼毒素以峰面積比計(jì)算，不大于0.5％，計(jì)算洗脫體積。60％乙醇溶液以1.5 BV/h體積流量繼續(xù)洗脫，每30 m L收集洗脫液，HPLC法測定鬼臼毒素含有量，真空干燥，稱重，重復(fù)3次。

由表3、圖3可知，20倍柱體積蒸餾水可以洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。30％乙醇洗脫溶液在不大于10倍柱體積時(shí)，不會(huì)損失太多目標(biāo)物；9倍柱體積的60％乙醇溶液可以將大部分目標(biāo)物解吸附；15倍柱體積的60％乙醇溶液可以將目標(biāo)物完全解吸附。以HPD-100型大孔吸附樹脂柱處理前后的總固物和鬼臼毒素為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂法可以有效去除雜質(zhì)，使鬼臼毒素的含有量大幅度提高，而且其回收率達(dá)到90％以上。

表3　XDA-1大孔吸附樹脂對(duì)鬼臼毒素的富集程度

2.5.3 60％乙醇洗脫體積流量研究 在上述研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察洗脫體積流量。取400 mL桃兒七水提取樣品液3份，上樣于20 mL已處理好的HPD100樹脂，以20倍柱體積蒸餾水洗脫至Mo1ish反應(yīng)呈陰性。10倍柱體積30％乙醇溶液洗脫后，再分別以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脫，HPLC法動(dòng)態(tài)監(jiān)測至其中的鬼臼毒素以峰面積比計(jì)算，小于0.5％，計(jì)算洗脫體積。結(jié)果表明，以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脫時(shí)，其洗脫體積分別為30、15、27倍柱體積，而且1.5 BV/h為最佳洗脫速度。

圖3　鬼臼毒素的洗脫曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了12種不同廠家、型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)桃兒七水提取物中鬼臼毒素的動(dòng)、靜態(tài)吸附與解吸附能力。結(jié)果表明，HPD100型樹脂的吸附能力最好，并且60％乙醇溶液可作為解吸附溶劑，洗脫物中鬼臼毒素的含有量達(dá)28.46％，遠(yuǎn)高于水提取物中的1.58 ％。

乙醇及甲醇等有機(jī)溶劑為提取鬼臼毒素的常用溶劑，而苯更能特異性地溶解、純化鬼臼毒素。但是，采用有機(jī)溶劑提取后，不能直接上樣于大孔吸附樹脂，這樣一方面會(huì)增加溶劑回收的工藝流程和成本，而另一方面也會(huì)造成環(huán)境污染和生產(chǎn)中的安全問題。本實(shí)驗(yàn)采用較大量的水加熱提取桃兒七藥材，冷卻后不經(jīng)濃縮，直接上大孔吸附樹脂柱吸附鬼臼毒素類成分，最后以少量乙醇溶液解吸附，獲得較高含有量的鬼臼毒素提取物。該方法避免了大量使用有機(jī)溶劑，而且簡便、快速、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Liu S H，Tian X，Chen X G，et al.Separation and determination of podophy11um 1ignans bymice11ar e1ectrokinetic chromatography［J］.JChromatgr A，2001，928（1）：109-115.

［2］ Radice PA，Bunn P A Jr，Ihde D C.Therapeutic tria1s with VP-16-213 and VM-26：active agents in sma11ce111ung cancer，non-Hodgkin' s 1ymphomas，and other ma1ignancies［J］. Cancer Treat Rep，1979，63（8）：1231-1239.

［3］ 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：藏藥卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：265.

［4］ Wen PH.Separation and purification of podophy11otoxin in Sinopodophyllum emodi Wa11［J］.JBaoJi Coll of Arts&Sci（Nat Sci），2002，22（4）：277-281.

［5］ 王寶璽，王日升，汪 青，等.植物桃兒七中鬼臼毒素的提取及HPLC分析［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30（11）：484-486.

［6］ 郭麗冰，王 蕾.常用大孔吸附樹脂的主要參數(shù)和應(yīng)用情況［J］.中國現(xiàn)代中藥，2006，8（4）：26-32.

［7］ 于鶴云，劉漢清，劉 嘉，等.D-101型大孔吸附樹脂純化黃蜀葵花總黃酮的工藝研究［J］.中成藥，2014，36（3）：520-525.

［8］ 趙惠茹，龍 靜，楊黎彬，等.HPD-300大孔吸附樹脂對(duì)山茱萸總皂苷分離工藝的優(yōu)化［J］.中成藥，2014，36（2）：416-419.

［9］ 馬瑞麗，李 敏，徐秀泉，等.大孔吸附樹脂制備尾葉香茶菜總二萜的工藝研究［J］.中成藥，2014，36（4）：848-851.

［10］ 李曉靜，李 巖，程雪梅，等.大孔樹脂分離純化秋水仙總生物堿的研究［J］.中成藥，2013，35（8）：1667-1671.

［11］ 劉世巍，丁建海.HPLC法測定桃兒七中鬼臼毒素的含量［J］.寧夏師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（6）：48-49，53.

［12］ 陳 燕，德 吉，劉云華，等.藏藥材桃兒七果實(shí)HPLC指紋圖譜的研究［J］.中成藥，2010，32（5）：708-711.

［13］ 熊文勇，魏朔南，岳 明.HPLC分析桃兒七中鬼臼毒素的含量［J］.中成藥，2010，32（5）：875-878.

［14］ 熊文勇，魏朔南，岳 明.桃兒七HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2010，32（11）：1850-1854.

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0212-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.051

*通信作者：李茂星（1973—），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯颗c開發(fā)。Te1：（0931）8994676，E-mai1：1imaox2005@a1iyun.com

作者簡介：王謹(jǐn)慧（1977—），女，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幣谥婆c制劑工程。Te1：13919917221

收稿日期：2014-11-03