超臨界流體萃取復(fù)方活血巴布膏中肉桂藥材的有效成分

畢建云， 劉善新， 梁瑞雪， 王 平*， 蘇 酩， 師 彬

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250000）

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超臨界流體萃取復(fù)方活血巴布膏中肉桂藥材的有效成分

畢建云1，2， 劉善新2， 梁瑞雪2， 王 平2*， 蘇 酩2， 師 彬3

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250000）

摘要：目的 優(yōu)選復(fù)方活血巴布膏中肉桂藥材的超臨界流體萃取條件。方法 以桂皮醛得率為指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考察了萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間等因素對(duì)藥材中有效成分得率的影響。結(jié)果 優(yōu)選出的工藝條件為萃取壓力20 MPa，萃取溫度35℃，萃取時(shí)間2.5 h。結(jié)論 在該提取條件下，桂皮醛得率、提取率均較高，工藝穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞：復(fù)方活血巴布膏；肉桂；桂皮醛；超臨界流體萃??；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

復(fù)方活血巴布膏為中藥復(fù)方制劑，具有溫經(jīng)活血、祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功能，適用于寒濕阻痹型骨性關(guān)節(jié)炎，其主含揮發(fā)油的藥材為肉桂、川芎、芥子。其中，肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presi的干燥樹皮，具有補(bǔ)火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效，其主要揮發(fā)性成分桂皮醛對(duì)堿性磷酸酶ALP活力、鈣含量以及鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)還具有明顯抗炎、除菌的效果［1-2］；川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛之功效，其主要有效成分阿魏酸能抑制血小板TXA2的釋放，對(duì)其活性有直接的拮抗作用，具有抗凝活血功能［3］；芥子為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子，具有溫肺豁痰利氣，散結(jié)通絡(luò)止痛之功效。本實(shí)驗(yàn)以桂皮醛得率為指標(biāo)，采用超臨界流體萃取法來提取肉桂、川芎、芥子中的揮發(fā)油成分。

1 超臨界流體提取揮發(fā)油條件篩選

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 U1timate 3000高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Chrome1eon7工作站（美國Thermo公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；HA220-50-06超臨界萃取裝置（江蘇華安科研儀器有限公司）。桂皮醛（批號(hào)FY1265VX53J，南通飛宇生物科技有限公司）。水為純凈水（美國Mi11ipore公司純水器制備）；所用試劑為色譜純或分析純。

1.1.2 藥材 所用藥材均購于山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院靳光乾研究員鑒定。

1.2 桂皮醛含有量測定［4-5］

1.2.1 色譜條件 Diamonsi1 C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（35∶65）；體積流量1 mL/min；檢測波長290 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。

1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的揮發(fā)油藥材120.25 g，粉碎（過50目篩），選擇萃取溫度為50℃，萃取壓力為30 MPa，萃取2.5 h，稱定收得揮發(fā)油的重量。然后，精密稱定揮發(fā)油0.1 g，置于25 mL量瓶中，定容至刻度，再精密吸取2 mL，置于25 mL量瓶中，定容至刻度，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL。

1.2.3 空白溶液的制備 按處方比例，稱取除肉桂外的揮發(fā)油藥材，粉碎（過50目篩），樣品提取及制備方法同上，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL。

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桂皮醛9.58 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度0.019 16 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.5 線性關(guān)系考察 取上述對(duì)照品貯備液適量，進(jìn)樣0.5、2、4、8、10、15 μL，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，桂皮醛在0.009 580～0.287 4 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=255.8X+0.081 50，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

1.2.6 空白試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品、供試品、缺肉桂空白對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下檢測。結(jié)果，對(duì)照品與供試品溶液在相同的保留時(shí)間處有相應(yīng)的峰，而缺肉桂空白對(duì)照無干擾峰，說明該測定方法的專屬性好、無干擾，見圖1。

A.桂皮醛對(duì)照品 B.樣品 C.缺肉桂空白圖1　桂皮醛的HPLC色譜圖

1.2.7 精密度考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，連續(xù)測定5次。結(jié)果，RSD為0.73％，表明儀器精密度良好。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 分別精密吸取供試品溶液10 μL，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果，RSD為1.19％，表明桂皮醛在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.9 重復(fù)性考察 精密稱取揮發(fā)油0.1 g，平行6份，按上述方法稀釋制備供試液，并測定桂皮醛的含有量。結(jié)果，RSD為0.80 ％，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取桂皮醛含有量已知的揮發(fā)油0.05 g，精密加入桂皮醛對(duì)照品，混勻，平行6份，按上述方法制備供試液，進(jìn)樣10 μL。結(jié)果，桂皮醛平均回收率為99.14％，RSD為0.98 ％。

2 正交試驗(yàn)優(yōu)選超臨界流體萃取揮發(fā)油工藝路線［6-8］

2.1 因素與水平 選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間作為考察因素，每種因素各取3個(gè)水平，再選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1　因素水平

2.2 試驗(yàn)安排及結(jié)果 按處方比例稱取含肉桂46.3 g的水提取藥材120.25 g，按正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，將桂皮醛的得率進(jìn)行直觀及方差分析，結(jié)果見表2、表3。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

直觀分析發(fā)現(xiàn)，桂皮醛得率各因素影響程度依次為C＞B＞A，但是后兩者相差不大；方差分析顯示，3個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油萃取率的影響不顯著，萃取時(shí)間相對(duì)具有一定的影響，時(shí)間越長，提取得率越大。從省時(shí)節(jié)能的角度考慮，確定最佳提取工藝為A1B1C3，即萃取溫度35℃、萃取壓力20 MPa、萃取時(shí)間2.5 h。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 采用上述優(yōu)化條件，平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，桂皮醛得率分別為18.98、18.40、18.89 mg/g，平均值為18.76 mg/g，RSD為1.68％；桂皮醛提取率分別81.10％、78.60％、80.13％，平均值為80.13％，RSD為1.68％，表明工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

超臨界流體萃取法常采用等溫減壓或等壓升溫的方法，將溶質(zhì)與萃取劑分離開，從而避免了用煎煮、濃縮、干燥等傳統(tǒng)方法提取中藥有效成分時(shí)，一些活性組分因高溫而被破壞的弊端。它可在較低的溫度下進(jìn)行，特別適合于熱敏性組分的提取，而且無溶劑殘留。文獻(xiàn)報(bào)道，采用超臨界流體萃取肉桂揮發(fā)油成分時(shí)，桂皮醛得率與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥材中桂皮醛的含有量為2.3％，小試驗(yàn)證中其提取率為80.13％，說明優(yōu)選的條件能較完全地提取出藥材中的揮發(fā)油成分。為了后續(xù)試驗(yàn)的方便進(jìn)行，以及能最大程度提取阿魏酸等極性較大的成分，本實(shí)驗(yàn)選擇加夾帶劑進(jìn)行二次提取，并對(duì)二次提取液中桂皮醛的得率進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果遠(yuǎn)小于揮發(fā)油中該成分得率［10］，更進(jìn)一步說明第一次就已經(jīng)較完全地提取出肉桂藥材中的揮發(fā)油成分。

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*通信作者：王 平（1974—），女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Te1：（0531）82949847，E-mai1：wangpingjinan@163.com

作者簡介：畢建云（1987—），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)員，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新制劑。Te1：15550486770，E-mai1：bjy1217@ 126.com。

基金項(xiàng)目：山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專項(xiàng)（2012ZHZX1C0405）；濟(jì)南市科技計(jì)劃（201219008）；濟(jì)南市青年科技明星計(jì)劃（20120142）

收稿日期：2014-09-02

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.046

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0191-03