肛門洗劑對肛瘺模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信號通路蛋白的影響

謝昌營， 趙曉娟， 吳成成， 肖慧榮， 萬 玙， 黃海鵬

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西南昌330006）

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肛門洗劑對肛瘺模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信號通路蛋白的影響

謝昌營， 趙曉娟， 吳成成， 肖慧榮*， 萬 玙， 黃海鵬

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西南昌330006）

摘要：目的 觀察肛門洗劑對肛瘺模型大鼠創(chuàng)面愈合率及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）信號通路蛋白表達(dá)的影響。方法健康SD大鼠40只隨機(jī)抽取10只，為正常對照組；余下30只建立肛瘺模型后，隨機(jī)分為模型對照組、肛門洗劑組和陽性對照組。各組連續(xù)干預(yù)14 d。檢測實驗?zāi)└鹘M大鼠TGF-β1信號通路相關(guān)蛋白及膠原蛋白co11agen I、co11agenⅢ表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組相比，3組TGF-β1、p-Smad3、co11agen I、co11agenⅢ均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組的上調(diào)更為明顯（P＜0.05）。與正常對照組相比，3組基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照的組下調(diào)更為明顯（P＜0.05）。結(jié)論 肛門洗劑能激活TGF-β1信號通路，抑制MMP-1的表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面纖維形成，加速創(chuàng)面愈合，這可能是其治療肛瘺的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：肛瘺；肛門洗劑；TGF-β1；p-Smad3；MMP-1

肛瘺是外科常見疾病，其不能自愈，不及時治療會反復(fù)形成肛周膿腫，目前治療方式多以手術(shù)切開為主，但術(shù)后創(chuàng)面愈合周期長是臨床多年來的治療難點。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究者們對肛瘺術(shù)后愈合的認(rèn)識逐漸放到了轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。TGF-β1是由多種細(xì)胞分泌的一類具有多重生物學(xué)效應(yīng)的生長因子，在膠原代謝中發(fā)揮著重要橋梁的作用，參與了創(chuàng)面愈合、瘢痕形成的全過程［1］。屬于Smads家族的Smad3作為TGF-β1的下游因子，其磷酸化后能夠介導(dǎo)胞外刺激傳遞到核內(nèi)，通過調(diào)控MMP-1的合成參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡和組織纖維化［2］，進(jìn)而對創(chuàng)面愈合產(chǎn)生重要影響。肛門洗劑是我院臨床治療肛瘺的有效中藥外用復(fù)方，本實驗通過復(fù)制肛瘺動物模型，同步檢測各組實驗大鼠TGF-β1信號通路蛋白的表達(dá)，探討TGF-β1信號通路與肛瘺的關(guān)系及從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)角度分析肛門洗劑治療肛瘺的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物許可證批號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 主要藥物與試劑 高錳酸鉀（濟(jì)南康福生制藥有限公司，140203）；肛門洗劑（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，20140401）；氯胺酮（福建古田藥業(yè)有限公司，KH140201）；TGF-β1抗體（美國Santa Cruz公司，SC-146）；p-Smad3抗體（美國CST中國分公司，#9520）；MMP-1抗體（美國Santa Cruz公司，SC-21731）；co11agen I抗體（美國Proteintech Group公司，14695-1-AP）；co11agenⅢ抗體（美國Proteintech Group公司，13548-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 分組 SD大鼠40只隨機(jī)抽取10只，為正常對照組，余下30只建立肛瘺模型，將建模成功的實驗大鼠隨機(jī)分為模型對照組、肛門洗劑組及陽性對照組。

1.2.2 肛瘺模型建立 參照王琛等［3］方法，采用綜合法制作肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型。術(shù)前對大鼠背部手術(shù)區(qū)域備皮，氯胺酮按100 mg/kg腹腔注射，麻醉后，在備皮區(qū)碘伏棉球常規(guī)消毒，距頸后2.5 cm處用創(chuàng)傷制作器在脊柱旁側(cè)0.5 cm處切割直徑約為1.8 cm的圓形創(chuàng)口，深達(dá)肌層，肌層傷口厚度約為0.3 cm，止血后在創(chuàng)面上加糞液1 mL，以油紗、敷料、膠帶固定，48 h去除覆蓋物，見傷口有膿性分泌物、有糞臭味者為造模成功。

1.2.3 給藥方法 肛門洗劑由五倍子、苦參、明礬、芒硝、桑寄生、荊芥、黃柏、白及組成，將上藥粉碎成粗粉，加水2 000 mL，浸泡15 min后武火煮沸，改文火再煎15 min，去渣存液，每150 mL為一包，使用時按1∶4稀釋后擦洗創(chuàng)面，紗布包扎，每天2次。陽性對照組使用高錳酸鉀，按1∶5 000稀釋后擦洗創(chuàng)面，紗布包扎，每天2次。模型對照組用等量生理鹽水擦洗創(chuàng)面，紗布包扎，每天2次。各組連續(xù)干預(yù)14 d。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 創(chuàng)面愈合率 參照潘友珍等［4］方法測量創(chuàng)傷面積，并計算創(chuàng)面愈合率。愈合率=（原始創(chuàng)面面積-當(dāng)前創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積。

1.3.2 組織蛋白提取與檢測 取創(chuàng)面肉芽組織，置入液氮凍存。取適量凍存組織按照約1∶8（質(zhì)量∶體積）的比例加入組織裂解液混合，勻漿后渦旋混勻，靜置1 h，18 000 rpm、4℃離心30 min，取上清，即為組織的總蛋白質(zhì)，Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝備用。采用Western b1ot法檢測目標(biāo)蛋白，將50 μg肉芽組織總蛋白加入2× SDS上樣緩沖液，100℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/ge1電泳，然后32 mA/ge1電泳至底部。轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后加入一抗4℃雜交過夜，加入二抗后再次室溫雜交2 h，漂洗后ECL曝光顯像，掃描，保存，分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進(jìn)行處理，計量資料均采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane' T2法，顯著性水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率 各組實驗大鼠創(chuàng)面愈合率見表1，顯示肛門洗劑組和陽性對照組的創(chuàng)面愈合率明顯優(yōu)于模型對照組（P＜0.05），肛門洗劑組較陽性對照組，促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果更好（P＜0.05）。

表1　實驗后各組間創(chuàng)面愈合率（±s，％）

注：與模型對照組比較，▲P＜0.05；與陽性對照組比較，*P＜0.05

組別　　動物數(shù)　　創(chuàng)面愈合率正常對照組　10—模型對照組　10　15.25±2.82肛門洗劑組　10　68.96±10.52▲*陽性對照組　10　45.76±8.13▲

2.2 實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達(dá) 各組實驗大鼠TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達(dá)見表2、圖1。表2顯示，創(chuàng)傷3組TGF-β1、p-Smad3均上調(diào)，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組上調(diào)更為明顯（P＜0.05）。創(chuàng)傷3組MMP-1均下調(diào)，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組下調(diào)更為明顯（P＜0.05）。

2.3 實驗后各組間co11agen I、co11agenⅢ的表達(dá) 實驗后各組實驗大鼠co11agen I、co11agenⅢ的表達(dá)見表3、圖2。表3顯示，創(chuàng)傷3組co11agen I、co11agenⅢ表達(dá)均上調(diào)，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且肛門洗劑組較模型對照組和陽性對照組上調(diào)更為明顯（P＜ 0.05）。

表2　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達(dá)（±s）

表2　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達(dá)（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05

1　p-Smad3　MMP-1正常對照組組別動物數(shù)　TGF-β 10　 0.12±0.02　 0.11±0.03　0.87±0.13模型對照組10　 0.19±0.03▲　0.22±0.04▲　0.52±0.10▲肛門洗劑組10　 0.54±0.12▲*#0.61±0.10▲*#　0.29±0.05▲*#陽性對照組10　 0.37±0.06▲*0.41±0.05*　0.41±0.07▲*

注：由左至右依次為正常對照組、模型對照組、肛門洗劑組、陽性對照組圖1　實驗后各組間TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表達(dá)

表3　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達(dá)（±s）

表3　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達(dá)（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05

組別　動物數(shù)　co11agen I　co11agenⅢ正常對照組10　0.12±0.01　0.14±0.02模型對照組　10　0.26±0.03▲　0.39±0.03▲肛門洗劑組　10　0.45±0.04▲*#　0.67±0.05▲*#陽性對照組　10　0.32±0.03▲*　0.37±0.03▲*

圖2　實驗后各組間collagen I、collagenⅢ的表達(dá)

3 討論

肛瘺是臨床常見的肛腸疾病，其發(fā)病率約為肛腸疾病總發(fā)病率的30％，合理的手術(shù)方式是治愈肛瘺的關(guān)鍵，但因術(shù)后創(chuàng)面多為開放性，同時由于支管殘腔眾多，故多存在術(shù)后愈合周期長等難以避免的治療難點［5］。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)和愈合是一個復(fù)雜而漸進(jìn)的動力學(xué)過程，它包括早期各種細(xì)胞的聚集和受損組織的清除、細(xì)胞的移動和增殖、局部產(chǎn)生大量膠原基質(zhì)及最后瘢痕形成過程，而其中起主導(dǎo)作用的便是TGF-β信號通路介導(dǎo)的纖維形成階段［6］。TGF-β的3個亞型中，TGF-β1在創(chuàng)面愈合過程中的靈敏性和特異性較強，被認(rèn)為與傷口愈合密切相關(guān)，能促進(jìn)纖維化和瘢痕形成，同時，TGF-β1被公認(rèn)為是最重要的成纖維細(xì)胞的強效趨化因子，是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成和降解的重要調(diào)節(jié)因素，它不僅能直接作用于成纖維細(xì)胞對基質(zhì)的合成，而且是刺激肉芽組織形成的最有效的細(xì)胞因子［7］。在大鼠創(chuàng)傷模型中，TGF-β1是最早表明能加速創(chuàng)傷愈合的生長因子，局部應(yīng)用TGF-β1的受體或中和抗體可延緩創(chuàng)面的修復(fù)過程［8］。進(jìn)一步研究TGF-β1信號通路，發(fā)現(xiàn)Smad家族是最早被證實的TGF-β1受體激酶的底物，是負(fù)責(zé)將TGF-β1信號從細(xì)胞表面的受體傳遞至核內(nèi)的關(guān)鍵信號分子，其中Smad3的羧基端可被TGF-β1磷酸化，而調(diào)控纖維形成的下游重要元件MMP-1的啟動區(qū)域存在Smad3結(jié)合元件，使得磷酸化的Smad3在轉(zhuǎn)位入核后可與之結(jié)合，從而直接作用于DNA，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對創(chuàng)面愈合起到調(diào)控作用［9-10］。

肛門洗劑以清熱解毒消腫、燥濕止癢止血為其基本功效，該洗劑由五倍子、苦參、明礬、芒硝、桑寄生、荊芥、黃柏、白及組成。五倍子味酸、澀，性寒，可治各種出血及癰腫瘡癤?？鄥⑽犊?，性寒，《仁齋直指方》云：“治下部瘡漏：苦參煎湯，日日洗之?！眱烧吆隙鵀榫Ｃ鞯\功效消痰，燥濕，止瀉，止血，善治口舌生瘡，瘡痔疥癬。芒硝潤燥軟堅，清火消腫。兩者合而為臣。桑寄生補肝腎、強筋骨，又治瘡毒。荊芥善破結(jié)聚氣，下瘀血，除濕痹，《簡便單方》中治痔漏腫痛云：“荊芥煮湯，日日洗之”。黃柏味苦，性寒，治瘡瘍腫毒。《神農(nóng)本草經(jīng)》云白及“主癰腫、惡瘡、敗疽，傷陰死肌，胃中邪氣”。諸藥合用，共奏清熱解毒、消腫燥濕之功。該中藥復(fù)方為江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科以五倍子湯為基礎(chǔ)自擬的一種外科洗液，在臨床安全、有效地使用了十余年。前期研究證實了肛門洗劑對于肛瘺、痔等肛周疾病具有改善患者臨床癥狀、加速創(chuàng)面愈合的良好功效［11-12］。本研究中，與正常對照組比較，模型對照組實驗大鼠TGF-β1信號通路相關(guān)蛋白有所升高，說明機(jī)體已通過TGF-β1信號通路啟動了創(chuàng)傷修復(fù)程序，但經(jīng)過肛門洗劑治療后，局部TGF-β1信號通路被明顯激活，能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合的TGF-β1及p-Smad3蛋白表達(dá)較模型對照組顯著增高，而能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)的MMP-1蛋白則表達(dá)降低，同時，創(chuàng)面愈合過程中的重要修復(fù)纖維co11agen I、co11agenⅢ的表達(dá)亦較模型對照組顯著上調(diào)，且療效明顯優(yōu)于陽性對照組。上述研究表明，相對于高錳酸鉀的單純殺菌作用，肛門洗劑除了具備清熱解毒、消腫燥濕的效應(yīng)外，更可能通過對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行干預(yù)性調(diào)節(jié)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)纖維的增殖，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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*通信作者：肖慧榮（1963—），男，主任醫(yī)師，從事肛腸外科臨床與實驗研究工作。E-mai1：jxszyygck@126.com

作者簡介：謝昌營（1984—），男，碩士，主治醫(yī)師，從事肛腸外科臨床與實驗研究工作。Emai1：xcyxcy85091@126.com

基金項目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（GJJ14618）

收稿日期：2015-02-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.038

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0167-03