排錢草藥材質(zhì)量評價方法的研究

鐘 鳴， 張寶璟， 王 超， 余勝民， 宗 楊， 馬驍馳， 張厚利 *

（1.廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西南寧530001；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116044）

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排錢草藥材質(zhì)量評價方法的研究

鐘 鳴1， 張寶璟2， 王 超2， 余勝民1， 宗 楊2， 馬驍馳2， 張厚利2 *

（1.廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西南寧530001；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116044）

摘要：目的 建立排錢草藥材的質(zhì)量評價方法。方法 采用TLC鑒別法，以三氯甲烷-甲醇（4∶1）為展開劑，在紫外光燈（254 nm）下檢視排錢草中N，N-二甲基色胺及5-甲氧基-N，N-二甲基色胺。再采用HPLC色譜法，對兩者含有量進(jìn)行測定。結(jié)果 在TLC鑒別中，254 nm下有一個明顯的熒光斑點，分離度良好；在HPLC色譜中，N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺進(jìn)樣量在2～30 μg/m L范圍內(nèi)與峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（n =5），兩者平均回收率分別為99.8％、100.5％，RSD分別為1.06％、1.83％。而且，不同采收期、部位的排錢草中這兩種成分含有量有明顯差異。結(jié)論 該方法可用于排錢草藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：排錢草；質(zhì)量評價；N，N-二甲基色胺；5-甲氧基-N，N-二甲基色胺；TLC；HPLC

排錢草為我國壯族民間常用草藥，來源于豆科植物排錢樹Phyllodium pulchellum（L.）Desv的干燥根，別名錢排草、疊錢草、錢串草，主要分布于福建、江西、兩廣等地，其性平，味澀，具有活血祛瘀、清熱利濕、除濕消腫、軟堅散結(jié)等功效，常用來治療急、慢性肝炎、血吸蟲病、肝脾腫大、子宮脫垂、跌打損傷等癥［1］。其中，排錢草總生物堿對人肝星狀細(xì)胞增殖具有抑制作用，并同時抑制肝纖維化相關(guān)膠蛋白的表達(dá)［2］；對化學(xué)損傷性肝纖維化具有較強(qiáng)的改善作用，能顯著降低血清ALP、ALT的活性，降低肝臟Hyp水平［3］；通過觀察大鼠肝臟組織病理改變，發(fā)現(xiàn)它可明顯減輕肝纖維化的病變程度，抑制肝纖維化的發(fā)展［3］；能顯著降低免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)［4］；能提高免疫性肝纖維化大鼠血清IFN-γ的水平，改善肝組織纖維化程度［5］。從排錢草中分離得到的化學(xué)成分主要為生物堿、醇、糖、揮發(fā)油以及酚等，其中種子中含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，同時還含有大黃素甲醚-1-葡萄糖基鼠李糖苷、半乳糖配甘露糖等［6］；根部含有a-香樹脂醇、白樺脂醇以及β-谷甾醇；全株富含檸檬酚、異檸檬酚、蟾毒色胺、禾草堿等［7］。另外，干寧等［8］從排錢草正丁醇萃取物中分離得到N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，排錢草這一民族草藥至今仍未被《中華人民共和國藥典》收載，有關(guān)其總生物堿化學(xué)成分的文獻(xiàn)報道也很少，故有必要對其建立一套完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究體系，以期為排錢草藥材的合理開發(fā)與質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Satorius BS210S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；U1timate 3000高效液相色譜儀，包括UV-DAD檢測器（美國Dionex公司）；Diamonsi1色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。甲醇、磷酸、氯仿、石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、丙酮均為分析純；乙腈為色譜純；水為HPLC柱色譜用水、娃哈哈純凈水。薄層色譜板（青島海洋化工有限公司）。N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺標(biāo)準(zhǔn)品（自制，經(jīng)HPLC色譜儀檢測，其純度＞99％）。排錢草由廣西南寧民族醫(yī)藥研究所藥理室鐘鳴教授提供。

2 排錢草藥材薄層鑒別

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取9月采自廣西的排錢草根部粗粉0.1 g，加入甲醇10 mL，超聲（100 Hz）處理30 min，甲醇補(bǔ)至10 mL，過濾，即得。

2.3 薄層條件 吸取供試品溶液8 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一塊以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，在以三氯甲烷-甲醇（4∶1）、氨飽和蒸氣為展開劑的溶劑中展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視，結(jié)果見圖1（a），熒光斑點清晰可見。然后，再噴以改良碘化鉍鉀溶液，日光下觀察，結(jié)果見圖1（b），供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)出相同顏色的橙色斑點。

a.254 nm下 b.日光下1～3.排錢草藥材的葉、枝、根 4.N，N-二甲基色胺 5. 5-甲氧基-N，N-二甲基色胺1 -3.1eaves，stems and rootsof Phllodium pulchellum 4.N，N-dimethy1tryptamine 5. 5-methoxy-N，N-dimethy1tryptamine圖1　排錢草薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram s of Phllodium pulchellum

3 排錢草藥材有效成分含有量的測定

3.1 N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺含有量的測定

3.1.1 對照品溶液的制備 同“2.1”項

3.1.2 供試品溶液的制備 同“2.2”項

3.1.3 色譜條件 Diamonsi1ODS色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（含0.03％磷酸），梯度洗脫（0～15 min，5∶95；15～25 min，90∶10；25～40 min，5∶95）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長220 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。理論塔板數(shù)按5-甲氧基-N，N-二甲基色胺峰計算，應(yīng)不低于3 000。然后，吸取對照品以及供試品溶液各10 μL，依次進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。

3.1.4 線性關(guān)系考察 精密稱取5-甲氧基-N，N-二甲基色胺對照品（0.5 mg/mL）溶液2、5、10、20、30 μL，再精密稱取N，N-二甲基色胺對照品（0.05 mg/mL）溶液2、5、10、20、30 μL，依次進(jìn)樣，在“3.1.3“項色譜條件下測定峰面積，以峰面積（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得到5-甲氧基-N，N-二甲基色胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=5.184 7X+0.512 5，r=0.998 2（n =5），N，N-二甲基色胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=5.121 8X+0.586 9，r=0.996 8（n =5）。結(jié)果表明，5-甲氧基-N，N-二甲基色胺在1～15 μg范圍內(nèi)，N，N-二甲基色胺在0.1～1.5 μg范圍內(nèi)，與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

A.排錢草 B.N，N-二甲基色胺 C.5-甲氧基-N，N-二甲基色胺A.Phllodium pulchellum B.N，N-dimethy1tryptamine C.5-methoxy-N，N-dimethy1tryptamine圖2　HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chrom atogram s

3.1.5 精密度考察 取5-甲氧基-N，N-二甲基色胺對照品溶液適量，在“3.1.3“項色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，測定其峰面積RSD為1.89％ （n =5），表明儀器精密度良好。

3.1.6 重復(fù)性試驗 取同一樣品制備5份供試品溶液，在“3.1.3“項色譜條件下測定N，N-二甲基色胺以及5-甲氧基-N，N-二甲基色胺的含有量。結(jié)果，兩者峰面積RSD分別為1.51％、1.45％ （n =5），表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液適量，在“3.1.3“項色譜條件下，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果，測定N，N-二甲基色胺以及5-甲氧基-N，N-二甲基色胺峰面積RSD分別為1.21％、1.18％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.8 加樣回收率試驗 取排錢草粉末0.1 g，共10份，取5份加入5-甲氧基-N，N-二甲基色胺（1 mg/mL）溶液2 mL，剩下5份加入N，N-二甲基色胺（1 mg/mL）對照品0.1 mL，按照“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“3.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣分析，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1和表2。

表1　5-甲氧基-N，N-二甲基色胺加樣回收率試驗Tab.1 Recovery tests for 5-m ethoxy-N，N-dim ethyltryptam ine

表2　N，N-二甲基色胺加樣回收率試驗Tab.2 Recovery tests for N，N-dimethyltryptam ine

3.1.9 樣品測定 取不同采摘時間、部位的排錢草藥材（產(chǎn)地廣西）適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“3.1.3“項色譜條件下分析，結(jié)果見表3。

表3　排錢草中兩種成分含有量測定結(jié)果（±s，n=5）Tab.3 Determ ination results of the contents of two constituents in Phllodium pulchellum（±s，n=5）

表3　排錢草中兩種成分含有量測定結(jié)果（±s，n=5）Tab.3 Determ ination results of the contents of two constituents in Phllodium pulchellum（±s，n=5）

采摘時間　部位　　含有量（g/100 g生藥）N，N-二甲基色胺　5-甲氧基-N，N-二甲基色胺3月　葉　　—2.90±0.12枝—1.37±0.15根　0.113±0.10　2.75±0.13 9月　葉　　—　3.40±0.12枝—1.54±0.13根　0.106±0.08　3.26±0.10 11月　根0.110±0.05　2.98±0.11

4 討論

在薄層色譜法鑒別試驗中，分別對三氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮、三氯甲烷-丙酮、乙酸乙酯-甲醇、三氯甲烷-丙酮-甲醇（均在氨飽和蒸氣中展開）進(jìn)行了考察，結(jié)果以三氯甲烷-甲醇（4∶1）、氨飽和蒸氣為展開劑的溶劑系統(tǒng)的薄層色譜保留行為最好，因此選擇該展開劑溶劑系統(tǒng)。同時，本實驗采用紫外燈（254 nm）下檢視和噴以碘化鉍鉀溶液顯色兩種方法來考察實驗結(jié)果，并互相印證，結(jié)果表明該方法具有分離度好、斑點清晰、簡便易行等特點，可用于排錢草藥材的鑒別。

提取溶劑選擇了甲醇、酸提堿沉-乙醇提取法、酸提堿沉-三氯甲烷萃取法進(jìn)行比較，同時對樣品進(jìn)行了回流提取與超聲提取的對比研究。結(jié)果顯示，選擇甲醇超聲提取藥材時，提取效果好、效率高。

本實驗將薄層色譜與高效液相色譜法結(jié)合，該質(zhì)量評價方法較以往單一評價指標(biāo)更科學(xué)、系統(tǒng)。通過對廣西不同時節(jié)、部位排錢草藥材中有效成分含有量的測定結(jié)果可知，其葉與枝均不含N，N-二甲基色胺，而根部則含有該成分，但由于其含有量較低，所以在薄層色譜中沒有檢測到相應(yīng)斑點，而利用敏感度較高的HPLC色譜則檢測到這一特征吸收峰。同時，排錢草的葉、枝、根部均含有5-甲氧基-N，N-二甲基色胺，并且在9月份藥材根部中，其含有量最高，另外葉中該成分的含有量明顯高于枝。綜上所述，在今后的質(zhì)量控制中，應(yīng)主要選擇廣西9月排錢草藥材的根部進(jìn)行重點研究，可達(dá)到更好的試驗效果，而其他地方不同時節(jié)排錢草藥材中有效成分的含有量測定還需作進(jìn)一步研究。

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Quality evaluation of Phllodium pulchellum

ZHONGMing1， ZHANG Bao-jing2， WANG Chao2， YU Sheng-min1， ZONG Yang2， MA Xiao-chi2，ZHANG Hou-1i2 *
（1.Guangxi Instituteof Nationality Medicine，Nanning 53OOO1，China；2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116O44，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish a method for the qua1ity eva1uation of Phllodium pulchellum.METHODS TLC was app1ied to detecting 5-methoxy-N，N-dimethy1tryptamine and N，N-dimethy1tryptamine in Phllodium pulchellum with ch1oroform-methano1（4∶1）as deve1oping so1ventunder the UV 1ight（254 nm）.Then HPLCwas adopted to determine the contents of these two constituents.RESULTS In TLC，it had a distinct f1uorescence spot under 254 nm with good separation.In HPLC，N，N-dimethy1tryptamine and 5-methoxy-N，N-dimethy1tryptamine showed good 1inear re1ationships in the ranges of 2 -30 μg/mL，whose average recoverieswere 99.8％（RSD= 1.06％）and 100.5％（RSD=1.83％）.In addition，the contents of these two constituents in different picking time and parts of Phllodium pulchellum showed obvious difference.CONCLUSION Thismethod can be used for the qua1ity contro1of Phllodium pulchellum.

KEYWORDS：Phllodium pulchellum；qua1ity eva1uation；N，N-dimethy1tryptamine；5-methoxy-N，N-dimethy1-tryptamine TLC；HPLC

*通信作者：張厚利，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥理學(xué)研究。Te1：15842660928，E-mai1：hou1izh@163.com

作者簡介：鐘 鳴，男，教授，研究員，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mai1：gxmyskjb@163.com

基金項目：遼寧省科技廳省自然科學(xué)基金（2015020667）

收稿日期：2015-04-29

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.029

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0130-04