HPLC波長切換法同時測定復方蓯蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷

曾建偉， 張珍麗， 鐘 黎， 陳發(fā)興， 蔡 晶*

（1.福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122；2.國家知識產(chǎn)權專利審量協(xié)作北京中心，北京100081；3.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州350002）

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HPLC波長切換法同時測定復方蓯蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷

曾建偉1， 張珍麗2#， 鐘 黎1， 陳發(fā)興3， 蔡 晶1*

（1.福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122；2.國家知識產(chǎn)權專利審量協(xié)作北京中心，北京100081；3.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州350002）

摘要：目的 建立HPLC波長切換法同時測定復方蓯蓉散（肉蓯蓉、淫羊藿、黃精）中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的含有量。方法 復方蓯蓉散50％甲醇提取液分析采用Agi1ent HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1％磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為330 nm（0～20 mim，松果菊苷和毛蕊花糖苷）和270 nm（20～30 mim，淫羊藿苷），柱溫30℃。結(jié)果 松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷分別在142.4～2 848 ng（r=0.999 5）、19.92～398.4 ng（r=0.999 8）和19.60～392.0 ng（r=0.999 9）范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率（n =6）分別為99.03％、99.97％、99.50％。結(jié)論 該方法簡便、準確、可靠，可用于復方蓯蓉散中上述3種成分的質(zhì)量控制。

關鍵詞：復方蓯蓉散；松果菊苷；毛蕊花糖苷；淫羊藿苷；HPLC；波長切換

復方蓯蓉散是根據(jù)中醫(yī)補腎益髓理論，結(jié)合臨床和科研實驗結(jié)果組成的中藥復方，已獲得國家授權發(fā)明專利（授權專利號201110302854.1），該方由肉蓯蓉10 g、淫羊藿10 g、黃精18 g組成。方中肉蓯蓉味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，有補腎陽、益精血的功效，取其“陰陽雙補”，為君藥；淫羊藿味辛、甘，性溫，歸腎、肝經(jīng)，能補腎陽、強筋骨，取其補益腎陽助君藥之力，為臣藥；其他為佐使藥。臨床主要用于治療阿爾茨海默?。ˋ1zheimer' s disease，AD）和帕金森病（Parkinson' s disease，PD）等老年性疾?。?-2］。已有研究表明，肉蓯蓉總苷及其松果菊苷對AD、PD及血管性癡呆患者具治療作用［3-6］，淫羊藿總黃酮及其淫羊藿苷對AD和血管性癡呆具防治作用［7-10］。雖有對單味藥材的質(zhì)控方法［11-15］，但無復方蓯蓉散的質(zhì)量標準。本實驗采用HPLC同時測定方中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的量，為復方蓯蓉散的質(zhì)量控制提供一種方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）；LK-1000A搖擺式中藥粉碎機（上海隆拓儀器設備有限公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR2130千分之一電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mi11i-Q超純水機（美國Mi11ipore公司）。乙腈為色譜純；水為超純水；甲醇、磷酸等均為分析純。

1.2 試藥 松果菊苷（批號111670-200503）、毛蕊花糖苷（批號111530-200505）、淫羊藿苷（批號110737-2004153）均購自中國食品藥品檢定研究院。肉蓯蓉、淫羊藿、黃精均購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂，經(jīng)本校梁一池教授分別鑒定為列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.的干燥葉、百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum co11.et Hems1的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agi1ent HC-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1％磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，10％→20％A； 10～15 min，20％→30％A；15～30 min，30％A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長330 nm（0～20 min）、270 nm（20～30 min）；進樣量10 μL；柱溫30℃。

2.2 混合對照品溶液 精密稱取松果菊苷對照品7.12 mg、毛蕊花糖苷對照品4.98 mg和淫羊藿苷對照品4.90 mg，分別置于25 mL量瓶中，用50％甲醇溶解，并稀釋至刻度，得到貯備液。分別精密吸取3種貯備液5、1、1 mL，置于10 mL量瓶中，加入50％甲醇稀釋，并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為142.4、19.92、19.60 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液 取復方蓯蓉散粉末約0.76 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加50％甲醇溶液至刻度，靜置30 min，超聲（功率300 W、頻率50 kHz）處理40 min，放冷，定容，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液 按處方比例，分別稱取不含肉蓯蓉、不含淫羊藿的藥材粉末，按“2.3”項下方法制備缺肉蓯蓉、缺淫羊藿的陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適應性試驗 分別精密吸取對照品溶液，陰性對照溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進樣分析，結(jié)果見圖1。表明陰性樣品對檢測無干擾，樣品與對照品在相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品無色譜峰，說明樣品中其他成分對待測成分無干擾。而且，3個成分與相鄰色譜峰均能達到基線分離，分離度均大于1.5。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X），進行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1　松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍Tab.1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of echinacoside，verbascoside and icariin

2.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，重復進樣6次，記錄色譜峰面積，計算松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為1.1％、1.4％、1.3％，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，每隔2 h進樣一次，共6次，記錄色譜峰面積，計算復方蓯蓉散中松果菊苷，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為1.6％、2.1％、0.92％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗 取同一批復方蓯蓉散粉末0.76 g，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄峰面積，計算復方蓯蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的平均含有量分別為1.376、0.138、0.193 mg/g，RSD分別為1.3％、1.9％、1.7％，表明該方法重復性良好。

2.10 回收率試驗 精密稱取含有量已知的復方蓯蓉散（批號20150201）粉末0.38 g，共6份，分別置25 mL量瓶中。另取12.5 mL松果菊苷儲備液置25 mL量瓶中，2.5 mL毛蕊花糖苷儲備液置10 mL量瓶中、2.5 mL淫羊藿苷貯備液置10 mL量瓶中，分別加50％甲醇，稀釋至刻度。于盛有樣品的量瓶中，分別精密加入上述松果菊苷溶液3.5 mL、毛蕊花糖苷溶液1.0 mL、淫羊藿苷溶液1.5 mL，再加50％甲醇至刻度。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的平均回收率，見表2。

表2　松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for echinacoside，verbascoside and icariin（n=6）

2.11 樣品測定 精密稱取樣品5批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄峰面積，并按外標法計算，結(jié)果見表3。

表3　復方蓯蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的含有量Tab.3 Contents of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder

3 討論

3.1 檢測波長 二極管陣列檢測器于200～400 nm在線掃描可知，松果菊苷和毛蕊花糖苷在330 nm處有最大吸收峰，而淫羊藿苷在330 nm則無吸收峰。雖然淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，但松果菊苷和毛蕊花糖苷在270 nm處為峰谷位置，若采用單一檢測波長，很難兼顧3種成分的檢測靈敏度，故在同一信號通道中設置了波長切換，使各成分均能在最高靈敏度下被檢測。

3.2 流動相 由于被檢測成分含有多個酚羥基，呈弱酸性，故在流動相中加入0.1％磷酸以抑制解離，防止峰的拖尾。有機相若用甲醇，峰變矮變鈍，因此選用乙腈，峰形變銳。若用等度洗脫，淫羊藿苷峰與前面的毛蕊花糖苷出峰相距甚遠，保留時間太長，故采用梯度洗脫，在保證分離度的前提下，拉近了兩峰的距離。經(jīng)過不斷優(yōu)化，將流動相確定為乙腈-1％磷酸，梯度洗脫。

3.3 結(jié)果分析 由表3可知，不同批次的含有量檢測結(jié)果無顯著性差異，說明復方蓯蓉散的調(diào)劑準確、質(zhì)量穩(wěn)定、方法可行。所建立的檢測方法適用于復方蓯蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的質(zhì)量控制，可為制訂本方其它制劑的質(zhì)量標準提供參考。

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Simultaneous determ ination of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder by HPLC wavelength sw itching

ZENG Jian-wei1， ZHANG Zhen-1i2#， ZHONG Li1， CHEN Fa-xing3， CAIJing1*
（1.Fujian University of Traditional ChineseMedicine，F(xiàn)uzhou 35O122，China；2.Patent Examination Coopration Center of The Patent Office，SIPO，Beijing 1OOO81，China；3.College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 35OOO2，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC wave1ength switchingmethod for simu1taneous1y determining the contents of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder（Cistanche deserticola Y.C.Ma，Epimedium brevicornu Maxim.and Polygonatum kingianum co11.et Hems1）.METHODS The ana1ysis of Compound Congrong Powder 50％ methano1ic extract was performed on Agi1ent HC-C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm）maintained at30℃，with acetonitri1e（A）-0.1％ phosphoric acid so1ution（B）as the mobi1e phase in a gradiente1ution manner ata f1ow rate of1.0 mL/min.The detection wave1engthswere 330 nm for echinacoside and verbascoside（0 -20 mim）and 270 nm for icariin（20 -30 mim）.RESULTS Themethod achieved good 1inearities in the ranges of142.4 -2 848 ng（r=0.999 5）for echinacoside，19.92 -398.4 ng（r=0.999 8）for verbascoside and 19.60 -392.0 ng（r=0.999 9）for icariin.Their average recoveries（n =6）were 99.03％，99.97％ and 99.50％，respective1y.CONCLUSION Thismethod is simp1e，accurate and re1iab1e，which can be used for the qua1ity contro1of three components in Compound Congrong Powder.

KEY WORDS：Compound Congrong Powder；echinacoside；verbascosid；icariin；HPLC；wave1ength switching

*通信作者：蔡 晶（1969—），女，教授，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合老年神經(jīng)病學。E-mai1：caij1@163.com

作者簡介：曾建偉（1976—），男，副研究員，研究方向為中藥分析及質(zhì)量評價。Te1：15859161976，E-mai1：zjwtcm@qq.com#并列第一作者：張珍麗（1976—），女，副研究員，研究方向為知識產(chǎn)權。E-mai1：zhangzhen1i@sipo.gov.cn

基金項目：國家衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金（WKJ-FJ-38）；福建省社發(fā)重點項目（2013Y0059）；校管-重點學科專項（X2014010-學科）

收稿日期：2015-03-10

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.017

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0084-04