美洲大蠊蛋白多肽納米粒的制備

黃丫丫， 劉光明， 李婧煒

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

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美洲大蠊蛋白多肽納米粒的制備

黃丫丫， 劉光明， 李婧煒*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

摘要：目的 以生物可降解材料聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（PEG-PLGA）為材料，研制美洲大蠊蛋白多肽納米粒。方法 采用復乳/溶媒蒸發(fā)法，以載藥量為考察指標，采用正交實驗設計對處方進行了優(yōu)化。結果 實驗最優(yōu)組合為油相中聚合物質(zhì)量濃度為25 mg/mL，超聲功率為120 W，超聲時間為50 s。制得的美洲大蠊蛋白多肽納米粒的載藥量為（1.19±0.09）％，平均粒徑為（150.3±7.2）nm，Zeta電位為（-28.2±4.5）mV。結論 可按照最優(yōu)處方組成，制備美洲大蠊蛋白多肽納米粒的口服藥物傳遞系統(tǒng)。

關鍵詞：美洲大蠊；蛋白多肽；納米粒；復乳/溶媒蒸發(fā)法；正交試驗

Preparation of Periplaneta americana polypeptide-loaded nanoparticles

HUANG Ya-ya， LIU Guang-ming， LI Jing-wei*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali671OOO，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory for Entomological and Biopharmaceutical R&D，Dali671OOO，China）

KEY WORDS：Periplaneta americana；po1ypeptide；nanopartic1es；doub1e emu1sion and so1vent evaporation method；orthogona1experiment

目前，惡性腫瘤已成為導致人類死亡的原因之一，嚴重危害人類的生命健康，抗腫瘤藥物已成為藥物研發(fā)的熱點［1］。美洲大蠊Periplaneta americana是蜚蠊科大蠊屬昆蟲，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有入藥記載，在大理白族地區(qū)民間慣用其治療惡瘡。近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物對死亡率排前十位的肺癌、胃癌、食管癌的腫瘤細胞的生長具有抑制或殺滅作用［2-3］。在治療肺癌、肝癌等時，對延長肺癌、肝癌患者生存時間和改善生活質(zhì)量方面治療效果明顯。前期對美洲大蠊提取物中的抗腫瘤活性成分的研究表明，多肽類物質(zhì)占美洲大蠊抗腫瘤活性部位總成分的70％左右［4］。人體胃腸道的pH環(huán)境極其復雜，胃部1.0～2.5；十二指腸5.1～6.6；空腸5.2～6.2；回腸6.8～7.8；盲腸5.7～6.4；結腸6.5～7.0［5］。由于大多數(shù)蛋白多肽類藥物不耐酸，易被胃酸水解失去生物活性，一些多肽還容易發(fā)生pH依賴性水解，這成為蛋白多肽類藥物口服吸收的第一道屏障，同時也是蛋白多肽類藥物口服吸收差，生物利用度低的重要原因［6］。大理大學劉光明教授研發(fā)的“美蠊精抗癌I號膠囊”已進入臨床試驗階段，將美洲大蠊提取物制備為膠囊雖然可以提高其口服吸收后的穩(wěn)定性［7-8］，但口服劑量較大，導致病人依從性較差。納米粒在傳送蛋白多肽藥物上已經(jīng)顯現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，研究發(fā)現(xiàn)，納米粒是通過細胞旁路或集合淋巴結（Peyer' s patches）的微皺褶細胞（microfo1d ce11s，M細胞）吞噬途徑吸收入血，納米粒包裹蛋白多肽藥物可以有效避免胃腸道分泌的酸和消化酶的破壞［9-11］。潘妍等［12］用PLGA為載體制備胰島素納米粒并進行了口服藥效學研究，其結果為4 h后血糖濃度顯著降低，10 h血糖濃度降至最低，藥物相對生物利用度（10.3±0.8）％，證明PLGANP可能成為大分子蛋白質(zhì)藥物口服給藥的新型載體。因此，本研究擬將美洲大蠊提取物用生物可降解的PEG-PLGA作為藥物載體制成納米粒，以期提高蛋白多肽類藥物經(jīng)口服吸收后的體內(nèi)穩(wěn)定性，并且通過納米粒的長循環(huán)及腫瘤組織透過性增強及滯留（EPR）效應［13-15］，有望最大限度地發(fā)揮蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的治療效果。

1 材料

1.1 儀器 TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；JY-II超聲細胞粉碎機（寧波新芝）；電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；90-2定時恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市大地自動化儀器廠）；3K-15高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）；HH-s2s數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市大地自動化儀器廠）；ZEN3600激光粒度分析儀（英國馬爾文）；XK96-A快速混勻器（江蘇姜堰市新康儀器廠）；DLSB-5/25低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 主要藥物及試劑 美洲大蠊蛋白多肽凍干粉（純度75％，大理大學藥學與化學學院）；PEG-PLGA［MePEG3000-PLGA40000（25∶75），相對分子質(zhì)量44 317，中國科學院成都有機化學研究所］。乙酸乙酯（分析純，天津化學試劑有限公司，批號20090216）；二氯甲烷（分析純，上海申博化工有限公司，批號1102101）；膽酸鈉（分析純，上海藍季生物有限公司，批號140306）；氫氧化鈉（NaOH，分析純，天津風船化學試劑科技有限公司，批號071120）；碳酸鈉（Na2CO3，分析純，西隴化工股份有限公司，批號110117）；五水硫酸銅（CuSO4.5H2O，分析純，廣州化學試劑有限公司，批號870904-1）；酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6.4H2O，分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號20140218）；牛血清白蛋白（BSA，分析純，上海伯奧生物科技有限公司，批號130724）；福林酚試劑（Fo1in pheno1，分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號73104861）；實驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 美洲大蠊納米粒的制備 稱取1.00 g美洲大蠊蛋白多肽凍干粉，置于10 mL量瓶中，加入少量水溶解，超聲30 min，然后定容至10 mL，制成美洲大蠊貯備液。

采用復乳/溶媒蒸發(fā)法［16-17］制備美洲大蠊納米粒，將50 μL貯備液加入到1 mL含PEG-PLGA的乙酸乙酯溶液中。超聲處理一定時間，然后加入10 mg/mL的膽酸鈉溶液2 mL，再超聲一定時間。超聲完畢后，加入到15 mL 5mg/mL的膽酸鈉溶液中，攪拌5 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，離心60 min（4℃，10 000 r/min），蒸餾水清洗兩次，收集納米粒。

2.2 Lowry法測蛋白方法的建立 按照焦春香等［18］建立的Lowry法，測定蛋白多肽含有量。

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱取BSA 0.006 45 g，置于25 mL量瓶中，加入超純水溶解，定容，搖勻，配制成0.258 mg/mL的標準蛋白溶液。精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，加水至1.0 mL。精密加入福林酚A溶液5 mL，搖勻，迅速置于35℃水浴中5 min，冷卻后再精密加入福林酚B溶液0.5 mL，邊加邊搖，置于55℃水浴中10 min，再置于冰水浴中10 min即可。超純水同法操作，為空白對照。按照紫外-可見分光光度法，在762 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）對溶液質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得到回歸方程為A=2.640C+ 0.033（r=0.999 0）。結果表明，蛋白在0.025～0.258 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度（A）具有良好的線性關系。

2.2.2 專屬性 按“2.1”項下方法制備空白納米粒，適量超純水重懸，然后加入3倍重懸液體積的二氯甲烷，分散、溶解材料，10 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液，最后按“2.2.1”項下方法顯色。同法處理美洲大蠊納米粒。以超純水同法操作，為空白對照，分別在400～900 nm范圍內(nèi)掃描紫外吸收圖譜，見圖1～3。

圖1　美洲大蠊紫外吸收圖譜Fig.1 UV absorption spectrum of Periplaneta americana

圖2　載美洲大蠊納米粒紫外吸收圖譜Fig.2 UV absorption spectrum of Periplaneta americanaloaded nanoparticles

圖3　空白納米粒紫外吸收圖譜Fig.3 UV absorption spectrum of waterloaded nanoparticles

美洲大蠊提取物、美洲大蠊納米粒及空白納米粒經(jīng)Lowry法顯色后，紫外吸收圖譜分別如圖1～3所示，可見在400～900 nm范圍內(nèi)，空白輔料無明顯吸收，對美洲大蠊納米粒中的蛋白多肽測定無影響，專屬性良好。

2.2.3 精密度試驗 精密量取質(zhì)量濃度為0.258 mg/mL的標準BSA貯備溶液0.90、0.50、0.15 mL，分別置具塞試管中，加水至1.0 mL，配成高、中、低3種質(zhì)量濃度（0.232 2、0.129 0、0.038 7 mg/mL），然后按照“2.2.1”項下方法，在762 nm處重復測定3次，統(tǒng)計各質(zhì)量濃度測定數(shù)據(jù)的相對標準偏差（RSD），即為精密度。結果表明，各質(zhì)量濃度下吸光度的RSD值均＜0.5％，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液100 μL，按“2.2.1”項下方法測定，于0、20、40、60 min時在762 nm處測定吸光度，統(tǒng)計測定數(shù)據(jù)的相對標準偏差（RSD）。結果，其RSD值為0.90％ （n =4），表明供試品在1 h內(nèi)吸收穩(wěn)定，顏色保持一致。

2.3 載藥量的測定 按“2.1”項下方法制備美洲大蠊納米粒，適量水重懸，置于2 m L離心管中。然后，加入3倍重懸液體積的二氯甲烷，分散、溶解材料，釋放美洲大蠊，10 000 r/min離心一定時間，小心吸取上清液，最后按“2.2.1”項下方法測定提取出來的上清液中蛋白質(zhì)的吸光度（A），根據(jù)標準曲線換算出相應的蛋白質(zhì)濃度（C1）。再取出3份等體積（V）的重懸液于事先稱定好質(zhì)量的離心管中，在烘箱中以90℃烘至恒定質(zhì)量，取出稱量，得到3份納米粒干質(zhì)量，算出其平均值，記為m-，載藥量（DLC）計算公式如下。

2.4 正交實驗優(yōu)化處方及方差分析 按“2.1”項下方法制備美洲大蠊納米粒，制備工藝中有機相溶劑、油相中聚合物的質(zhì)量濃度、第1次超聲的功率、第1次超聲時間都可能影響納米粒的載藥量，故對這些因素均進行了單因素考察。在單因素考察的基礎上，選取油相中聚合物的質(zhì)量濃度、第1次超聲功率與第1次超聲時間作為考察因素，按正交設計表L9（34）安排試驗，以載藥量為優(yōu)化指標，根據(jù)方差分析確定優(yōu)化處方。各因素水平表見表1，試驗結果見表2、表3。

表1　L9（34）因素水平Tab.1 Factors and levels of L9（34）

表2　正交試驗結果（n=3）Tab.2 Results of orthogonal test（n=3）

表3　方差分析結果Tab.3 Results of analysis of variance

結果顯示，各因素作用主次為B＞C＞A。超聲功率（B）和超聲時間（C）對于美洲大蠊納米粒的載藥量有顯著影響（P＜0.05），而聚合物質(zhì)量濃度（A）（P＜0.1）對美洲大蠊納米粒的影響不顯著。最終確定，優(yōu)化水平組合為A3B1C3，即油相中聚合物的質(zhì)量濃度為25 mg/mL，第1次超聲功率為120 W，第1次超聲時間為50 s。

2.5 工藝驗證 按優(yōu)化處方制備3批美洲大蠊納米粒，測得3批納米粒平均載藥量（DLC）為（1.19±0.09）％，該值高于正交實驗表中最優(yōu)組合的載藥量，但與最優(yōu)組合的載藥量間無顯著性差異，證明A3B1C3為最優(yōu)組合。結果見表4。

2.6 粒徑和Zeta電位測定 按最優(yōu)處方條件，分別制備3批空白納米粒和美洲大蠊納米粒，將納米?；鞈乙河贸兯m當稀釋，ZEN3600激光粒度分析儀測定納米?；鞈乙旱牧胶蚙eta電位。結果，空白納米粒粒徑為（126.2±4.6）nm、PdI為0.129，Zeta電位為（-27.1±5.8）mV；美洲大蠊納米粒粒徑為（150.3±7.2）nm、Pd I為0.234，Zeta電位為（-28.2±4.5）mV。粒徑分布圖見圖4、圖5。

圖4　空白納米粒的粒徑分布圖Fig.4 Size distribution of water-loaded nanoparticles

圖5　載美洲大蠊納米粒的粒徑分布圖Fig.5 Size distribution of Periplaneta americana-loaded nanoparticles

3 討論

復乳/溶媒蒸發(fā)法是目前制備水溶性藥物、多肽、蛋白質(zhì)、基因藥物納米粒常用的方法［19-21］。該法的優(yōu)點為制得的納米粒載藥量高、納米粒呈多孔表面、藥物易于釋放等［22］。采用該方法制備納米粒，進行了四因素三水平的正交實驗。結果表明，第1次超聲功率的影響最大，超聲功率太小，不能形成穩(wěn)定的初乳，而超聲功率過大又會影響蛋白的活性，這都是導致載藥量不高的原因，所以選擇合適的第1次超聲功率很重要。油相中聚合物的質(zhì)量濃度對于載藥量的影響不顯著。超聲時間越長，載藥量也越高，所以適當加長時間，有利于藥物的包載。

理論上載藥量的大小是由載體和藥物本身的性質(zhì)所決定的，載藥量隨著藥物質(zhì)量濃度的升高而增高，為了提高載藥量，采用美洲大蠊提取物的飽和溶液。單因素考察時，分別選擇了二氯甲烷和乙酸乙酯作為有機相溶劑，結果發(fā)現(xiàn)有機相溶劑對載藥量沒有明顯的影響；由于美洲大蠊是水溶性藥物，主要存在于納米粒的內(nèi)水相內(nèi)，預實驗結果表明，初乳再次乳化為復乳的過程中的超聲功率和時間未對載藥量產(chǎn)生明顯的影響，所以上述因素均未納入正交設計實驗中。

蛋白質(zhì)含量測定的方法有很多種，各有優(yōu)缺點。本課題選用快速簡便的Lowry法，其靈敏度較雙縮脲法和紫外分光光度法高，是目前應用最為廣泛的一種方法［23］。在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡合物，此絡合物可將試劑磷鉬酸-磷鎢酸還原，形成深藍色混合物（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），所形成的混合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。

在加入福林酚B試劑時要特別注意，因為該試劑只在酸性條件下穩(wěn)定，但該反應的第一步加入的試劑是呈堿性的，所以加福林酚B試劑時要注意將每一管充分混勻。雖然藥典上使用的檢測波長是650 nm，但采用紫外分光光度計在400～900 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描時，發(fā)現(xiàn)對照品和供試品溶液在762 nm處均有最大吸收且背景干擾小，故采用762 nm作為該實驗Lowry法測蛋白的檢測波長。

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*通信作者：李婧煒（1985—），女，博士，講師，主要從事藥劑學研究工作。Te1：（0872）2251475；E-mai1：1ijw2013@126.com

作者簡介：黃丫丫（1990—），女，碩士生，主要從事藥劑學研究工作。E-mai1：m18313001109@163.com

基金項目：云南省應用基礎研究計劃青年項目（2014FD044）；云南省教育廳科學研究基金項目重點項目（2014Z136）

收稿日期：2015-03-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.014

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0067-06