代謝組學技術(shù)比較肝豆靈片與青霉胺的排銅機制

蔣懷周， 王 鍵， 董繼揚， 劉 磊

（1.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，安徽合肥230031；2.廈門大學電子科學系，福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室，福建廈門361005；3.亳州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，安徽亳州236800）

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代謝組學技術(shù)比較肝豆靈片與青霉胺的排銅機制

蔣懷周1， 王 鍵1， 董繼揚2， 劉 磊3

（1.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，安徽合肥230031；2.廈門大學電子科學系，福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室，福建廈門361005；3.亳州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，安徽亳州236800）

摘要：目的 探討肝豆靈片（大黃、黃芩、黃連、半枝蓮等）和青霉胺對大鼠的代謝物，以比較兩者排銅機制異同。方法 適應性飼養(yǎng)1周后，大鼠被隨機分為對照組、模型組、肝豆靈組、青霉胺組。造模結(jié)束后，取各組大鼠血清樣品分析其核磁共振譜峰。結(jié)果 模型組大鼠血清乳酸、糖蛋白、肌酸、肌酐、谷氨酰胺、精氨酸的量升高，葡萄糖、甜菜堿、膽堿、磷酸膽堿、脂質(zhì)的量降低；青霉胺組大鼠血清葡萄糖、甜菜堿、膽堿、膽堿磷酸、脂質(zhì)的量升高，糖蛋白、乳酸、肌酸、肌酐、谷氨酰胺的量降低；肝豆靈組大鼠血清3-羥基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、膽堿、膽堿磷酸、葡萄糖、脂質(zhì)的量升高，谷氨酰胺、乳酸、肌酸、肌酐、精氨酸的量降低。結(jié)論 青霉胺與肝豆靈均可明顯調(diào)節(jié)銅負荷大鼠的葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酐、膽堿、磷酸膽堿、谷氨酰胺和脂質(zhì)向正常范圍回歸的趨勢。而肝豆靈片還可調(diào)節(jié)鳥氨酸循環(huán)、支鏈氨基酸、3-羥基丁酸及氨的代謝。

關鍵詞：肝豆靈片；青霉胺；代謝組學；血清；核磁共振譜（1H-NMR）；排銅機制

Com parison ofmechanism for copper-excretion between Gandouling Tablets and penicillam ine by metabonom ics

JIANG Huai-zhou1， WANG Jian1， DONG Ji-yang2， LIU Lei3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Anhui University of ChineseMedicine，Hefei23OO31，China；2.Department of Electronic Science，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance；Xiamen University，Xiamen 361OO5，China；3.The 2ndNeurology Department，The People's Hospital of Bozhou City，Bozhou 2368OO，China）

ABSTRACT：AIM To app1y metabonomics to the exp1oration of differences in mechanism for copper-excretion between Gandou1ing Tab1ets（Rheum officinale Bai11.，Scutellaria baicalensis Georgi，Coptis chinensis Franch.，Scutellaria barbata D.Don，etc.）and penici11amine.METHODS After adaptive breeding for one week，the tested rats were random1y divided into four groups，inc1uding contro1，mode1，Gandou1ing Tab1ets and penici11amine group.Aftermode1ing，the sera of a11groupswere ana1yzed by1H-NMR spectroscopy.RESULTS The mode1 group showed increased 1eve1s of 1actate，g1utamine，g1ycoprotein，creatine，creatinine and arginine，together with decreased 1eve1s of g1ucose，betaine，cho1ine，phosphocho1ine and 1ipid.Penici11amine group had increased 1eve1s of g1ucose，betaine，cho1ine，phosphocho1ine and 1ipid，togetherwith decreased 1eve1s of g1utamine，g1ycoprotein，1actate，creatine and creatinine.Whi1e Gandou1ing Tab1ets increased 3-hydroxybutyrate，1eucine，iso1eucine，va1ine，cho1ine，phosphocho1ine，g1ucose and 1ipid，but decreased g1utamine，1actate，creatine，creatinine and arginine.CONCLUSION There is a simi1arity ofmechanism for copper excretion between Gandou1ing Tab1ets and penici11amine，main1y in the metabo1ic regu1ation of g1utamine，1actate，creatine，creatinine，g1ucose，cho1ine，phosphocho1ine and 1ipid returning to norma1.Moreover，Gandou1ing Tab1ets can regu1ate themetabo1isms of ornithine cyc1e，3-hydroxybutyric acid and branched chain amino acids.

KEY WORDS：Gandou1ing Tab1ets；penici11amine；metabonomics；serum；1H nuc1ear magnetic resonance （1H-NMR）；copper-excretion mechanism

Wi1son?。╓i1son's disease，WD）于1912年被英國神經(jīng)病學家Samue1A1exander Kinnier Wi1son首次報道，并因而得名。該病系銅代謝障礙疾病，過量的銅沉積于患者體內(nèi)，累及多系統(tǒng)、多器官，引起一系列臨床表現(xiàn)，如：肝硬化、腎損傷、肌張力障礙、肢體震顫、語言含糊、角膜K-F環(huán)等。如不積極治療，可對患者的生活能力產(chǎn)生嚴重的影響，甚至導致死亡。西醫(yī)治療本病以排銅為主，重金屬絡合劑青霉胺（penici11amine，PA）是其首選口服藥。中醫(yī)從整體角度治療本病，亦具一定優(yōu)勢。其中，肝豆靈片是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，多年的臨床應用及科研證明，該方治療WD不僅安全有效，還具有保護肝臟、改善該病患者神經(jīng)功能的效果［1-2］。本實驗以核磁共振（nuc1earmagnetic resonance，NMR）代謝組學為研究方法，初步探討肝豆靈和青霉胺的排銅機制異同。

1 材料及方法

1.1 動物 44只無特定病原體級別（specified pathogen free，SPF）Wistar大鼠，3月齡，體質(zhì)量160～200 g，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（皖）2011-002，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學省部共建新安醫(yī)學教育部重點實驗室，室溫20～22℃，相對濕度40％～60％。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 肝豆靈片（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，0.3 g/片，批號：皖藥制字Z20050071），由生大黃Rheum officinale Bai11.、黃芩Scutellaria baicalensis Georgi、黃連Coptis chinensis Franch.、半枝蓮Scutellaria barbata D.Don、穿心蓮Andrographis paniculata Nees、澤瀉Alisma orientalis Juzep.、萆薢Dioscorea septem loba Thunb.、金錢草Lysimachia christinae Hance、石菖蒲Acorus tatarinowii Schott、丹參Salvia miltiorrhiza Bge、姜黃Curcuma longa L.、莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Va1.、雞血藤Spatholobus suberectus Dunn、郁金Curcuma weuyujin Y.H.Chen et C.Ling組成。制備工藝：按處方比例稱取藥材，以70％乙醇回流提取2次，第一次10倍量1.5 h，第二次8倍量1.0 h，藥渣加8倍量水再提取1次，分別減壓濃縮藥液至一定濃度、混合、真空減壓干燥，得干浸膏，再加入淀粉、單糖漿和硬脂酸鎂等輔料，壓片，規(guī)格0.3 g/片。質(zhì)控標準為高效液相色譜（high performance 1iquid chromatography，HPLC）法測定鹽酸小檗堿的量，以其含有量不低于0.5％為合格。青霉胺（上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格0.125 g/片，國藥準字H31022286）。

氘代重水（deuterium oxide，D2O，美國CILantro公司）；3-三甲基硅基-1-丙磺酸鈉（3-trimethy1si1y1-1-propane su1fonic acid sodium sa1t，DSS，美國Sigma公司）；硫酸銅（國藥集團化學試劑有限公司）；乙醚（上海蘇懿化學試劑有限公司）；GL-20A全自動冷凍高速離心機（湖南儀器儀表總廠）；Varian 500 MHz超導NMR譜儀（美國安捷倫公司）。

1.3 模型制備 適應性飼養(yǎng)1周后，大鼠被隨機分為四組：對照組、模型組、青霉胺組、肝豆靈組，每組11只。對照組始終自由進食、攝水，其余3組以銅負荷法［3］造模：連續(xù)12周喂飼含硫酸銅的飼料（1 g/kg）和水（0.185％）。自第7周開始，分別以肝豆靈（0.486 g.kg-1.d-1）和青霉胺（0.09 g.kg-1.d-1）灌胃肝豆靈組、青霉胺組大鼠，對照組和模型組以等容量生理鹽水（0.9％ NS）灌胃，直至造模結(jié)束。

1.4 取材及檢測［4］第12周造模結(jié)束后，大鼠禁食12 h，乙醚吸入法麻醉，經(jīng)腹主動脈采集新鮮血液，4℃低溫離心10 min（3 000 r/min）取上清液，-80℃超低溫冰箱儲存血清，以備NMR代謝組學檢測。核磁檢測時，常溫解凍血清，將400 μL血清與200 μL磷酸鹽緩沖液（0.2 mo1/L Na2HPO4/NaH2PO4，99.9％ D2O）混合，調(diào)整溶液酸堿度至7.4，以消除酸堿度變化對實驗的影響，加入3-三甲基硅丙烷磺酸鈉（DSS）作為化學位移零點的定標，震蕩混合均勻后，4℃低溫離心10min（10 000 r/min），取550 μL上清液移入5 mm NMR管，以采集樣品的1H-NMR譜。實驗采用5 mm HCN三共振探頭，溫度300 K，譜寬5 kHz，信號累加256次，采用NOEPR-CPMG脈沖序列進行數(shù)據(jù)采樣。其中，預飽和模塊、自旋回波模塊分別抑制水峰信號和蛋白、脂蛋白所產(chǎn)生的寬峰。結(jié)果見圖1。

1.5 譜圖處理和統(tǒng)計學方法［4］采用MestreNova 9.0軟件對所有譜圖進行相位調(diào)整、校正基線和譜峰對齊。以0.02為等間隔對化學位移δ0.2～4.6區(qū)域進行分段積分，得到一個數(shù)據(jù)矩陣。矩陣的每一行和每一列分別代表一個樣本和一個積分段，用面歸一化方法對數(shù)據(jù)矩陣進行歸一化，以主成分分析法（principa1 component ana1ysis，PCA）對所得數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見圖2～5。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況觀察 正常組大鼠始終狀態(tài)佳，作息規(guī)律，皮毛光滑潤澤，食欲及二便正常。造模2周后，模型組、兩給藥組大鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，飲食攝水減少，精神不振，體質(zhì)量增加不明顯，皮毛光澤差，大便不成形，小便減少表現(xiàn)。藥物干預后，與模型組相比，肝豆靈和青霉胺組大鼠攝水飲食量增加，精神不振狀況改善，大便稍成形，小便量增多。

2.2 大鼠血清典型1H-NMR譜 見圖1。

圖1　大鼠血清樣品典型1 H-NMR譜Fig.1 Typical1H-NMR spectrum of serum sam ples in rats

2.3 血清1H-NMR譜圖處理結(jié)果 對數(shù)據(jù)的PCA分析結(jié)果如圖2～5所示。得分圖（圖2A～5A）中，每一個圓點和三角分別代表不同組別的每一個樣品。對照組和模型組、模型組和肝豆靈組、模型組和青霉胺組，分布于兩個不同的區(qū)域，能明顯地區(qū)分開，說明這些兩兩對比的組間代謝物有差異，造模成功。負載圖（圖2B～5B）的每個點代表譜圖上的一個譜峰段，偏離零點越遠的點，對兩組的分類貢獻越大，越有可能是潛在的組間差異代謝物。其中，圖2B中，169這個點代表的是乳酸峰，它離零點最遠，對分類貢獻最大，提示模型組血清乳酸水平升高顯著，而且遮掩了其它譜峰。為尋找更多的血清差異代謝物，我們將乳酸峰去除后再做主成分分析，結(jié)果見圖3。圖3A可見，去除乳酸峰后，對照組和模型組樣本仍分布于不同區(qū)域。

圖2　對照組、模型組得分圖和負載圖Fig.2 PCA models of1H-NMR metabolom ics data for the control group and model group

圖3　去除乳酸峰后，對照組、模型組得分圖和負載圖Fig.3 PCA models of1H-NMR metabolom ics data for the control group and model group w ithout lactate peak

對比模型組與對照組、肝豆靈組與模型組、青霉胺組與模型組，我們找出3組對分類貢獻比較大的代謝物，并將這些代謝物、化學位移及其相應變化列出（表1），包括3-羥基丁酸（δ1.20）、谷氨酰胺（δ2.12）、糖蛋白（δ2.04）、乳酸（δ1.32，δ4.10）、亮氨酸（δ0.94）、異亮氨酸（δ0.93，δ1.0）、纈氨酸（δ0.97，δ1.02）、肌酸（δ3.04）、肌氨酸酐（δ3.05）、葡萄糖（δ3.23～3.80）、甜菜堿（δ3.25）、膽堿（δ3.19）、磷酸膽堿（δ3.21）、精氨酸（δ1.71）、脂質(zhì)（δ1.29～1.30）。表1中，“↑↑”和“↑”表示代謝物的量升高，且具有統(tǒng)計學意義（↑↑，P＜0.01；↑，P＜0.05）；“↓↓”和“↓”表示代謝物的量降低，且具有統(tǒng)計學意義（↓↓，P＜0.01；↓，P＜0.05）；“-”表示代謝物的量變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4　模型組、肝豆靈組得分圖和負載圖Fig.4 PCA models of1H-NMR m etabolom ics data for them odel group and Gandouling Tablets group

圖5　模型組、青霉胺組得分圖和負載圖Fig.5 PCA models of1H-NMR metabolom ics data for the penicillam ine group and model group

表1　大鼠血清特征代謝物Tab.1 Typical serum metabolites in rats

3 討論

正常人自飲食攝入的銅約為2.5～5 mg/d。銅被腸道吸收后，先與白蛋白疏松結(jié)合并進入肝臟，在肝細胞中，銅與a-2球蛋白牢固結(jié)合形成銅藍蛋白，后者具有氧化酶活性。目前，WD的發(fā)病機制尚未完全明確，但似乎涉及銅與前銅藍蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)運蛋白銅藍蛋白減少，未經(jīng)結(jié)合的銅大量進入血循環(huán)，沉積在以肝、腦、腎和角膜組織為主的全身各臟器，引起一系列臨床癥狀。自從John Wa1she于1956年提倡以青霉胺治療WD以來，該藥一直是WD的首選口服藥。青霉胺含N、O、S配位原子，是銅的絡合劑，可絡合血液和組織中過多的游離銅，形成穩(wěn)定的水溶性復合物經(jīng)小便排出，從而阻止銅在體內(nèi)繼續(xù)沉積，恢復機體正常的生理功能。中醫(yī)治療本病，根據(jù)患者多具肢體震顫僵直、口渴煩熱、口苦口臭、鼻衄、齒衄、黃疸、肝部癥積、小便短赤、舌質(zhì)紅、苔黃或者黃膩、脈弦滑或者弦數(shù)等表現(xiàn)，楊任民、張笑平綜合分析認為本病病機要點為肝膽濕熱、阻滯血絡、瘀濁互結(jié)，治當以清熱利濕通腑、行氣化瘀散結(jié)之方，組方肝豆湯治療本病，肝豆靈片是其優(yōu)化組合片劑。其中，大黃清熱通腑，蕩滌熱結(jié)；黃連、黃芩、半枝蓮、穿心蓮苦寒清熱，瀉火解毒；萆薢、澤瀉、金錢草、石菖蒲瀉熱通淋、利濕祛濁；丹參、姜黃、莪術(shù)、雞血藤、郁金活血行氣、祛瘀散結(jié)。全方以祛邪為主，共奏清熱利濕通腑、行氣化瘀散結(jié)之功。本方雖不是銅的絡合劑，但多年的臨床及科研反復驗證，確具排銅作用［5-7］。

本實驗模型組大鼠血清乳酸、谷氨酰胺、糖蛋白、肌酸、肌酐、精氨酸水平升高，葡萄糖、甜菜堿、膽堿、磷酸膽堿、脂質(zhì)水平降低，提示銅在機體過度沉積涉及膽堿、糖、氨基酸、脂質(zhì)等代謝，對肝臟、腎臟和神經(jīng)等多種組織器官產(chǎn)生影響，與臨床報道相符合。

銅參與生物體諸多酶的合成，其中包括處于線粒體呼吸鏈末端的細胞色素C氧化酶。雖然機理尚未闡明，但銅過量沉積可影響呼吸鏈，使有氧呼吸發(fā)生障礙，無氧代謝增加，導致乳酸升高［8］。糖蛋白主要分布在細胞表面、細胞內(nèi)分泌顆粒和細胞核內(nèi)，也可被分泌出細胞構(gòu)成細胞外基質(zhì)成分，是重要的生物信息分子，在生理和病理過程中起到生物識別的作用。酶的水解作用可以使糖蛋白糖鏈次末端的半乳糖暴露，被肝細胞識別，通過胞飲作用進入肝細胞被分解。肝臟是銅沉積所損傷的重要器官，模型大鼠糖蛋白水平增高，可能與肝損傷、肝細胞無法正常分解糖蛋白有關。

銅過量可通過活性氧族介導的氧化應激，引起細胞膜性結(jié)構(gòu)通透性增加，導致細胞凋亡。膽堿在膽堿激酶的催化下合成磷酸膽堿，二者參與磷脂代謝，是細胞膜性結(jié)構(gòu)的重要組成部分，對維持正常的細胞周期、通透性和信息傳遞起著重要作用。以代謝組學對肝細胞凋亡進行研究，發(fā)現(xiàn)膽堿的量隨肝細胞凋亡的嚴重程度而下降［9］。此外，膽堿是生物體重要的甲基供體，在提供甲基時，膽堿在膽堿脫氫酶、甜菜醛脫氫酶的作用下先氧化生成甜菜堿，再由甜菜堿提供甲基。由于甲基在神經(jīng)、內(nèi)分泌、泌尿和免疫等系統(tǒng)中具有十分重要的作用，所以穩(wěn)定的甲基供體對于生物體來說非常重要。模型組膽堿、磷酸膽堿和甜菜堿的量降低，提示銅過量可能影響了大鼠的磷脂代謝和甲基代謝。

模型組血清精氨酸和谷氨酰胺的增高，可能與氨的代謝紊亂有關：肝臟是機體最大的氨代謝器官，腎臟是排泄氨的重要場所。氨在肝臟通過精氨酸參與的鳥氨酸循環(huán)，代謝為無毒的尿素經(jīng)腎臟排出。腎臟不僅排出尿素，還以NH4+的形式排出大量的氨。銅沉積引起肝功能受損鳥氨酸循環(huán)障礙，或腎小管受損導致氨的排泄受阻，都有可能引起血氨增高。氨在ATP的供能條件下，結(jié)合a-酮戊二酸和谷氨酸，生成谷氨酰胺。在代謝組學中，谷氨酰胺是評估肝損傷和肝性腦病的一個指標［10］。同時，它與神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關，有學者經(jīng)實驗分析認為，它有可能成為中樞神經(jīng)毒性檢測的標志物［11］。

肌酸由甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、精氨酸合成，其最終產(chǎn)物為肌酐并隨尿排出。若腎功能發(fā)生障礙，肌酐排出受阻，則血中肌酐水平升高。臨床上，血肌酐水平的測定有助于了解腎功能。本實驗銅負荷大鼠血肌酐升高，符合傳統(tǒng)生化檢測結(jié)果，提示銅中毒對大鼠腎功能有所損害。

比較青霉胺和肝豆靈片，兩者對于銅負荷大鼠的排銅機制具有異同點。相同點主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)乳酸、肌酸、肌酐、葡萄糖、膽堿、磷酸膽堿、谷氨酰胺和脂質(zhì)的代謝，使其具有向正常范圍回歸的趨勢。不同點是：1、青霉胺還可升高甜菜堿、降低糖蛋白水平。甜菜堿是機體重要的甲基供體，糖蛋白參與細胞信號識別，與諸多疾病的發(fā)病機理密切相關［12］。結(jié)合其它代謝物的變化，青霉胺的排銅機制除涉及膽堿、葡萄糖、脂、氨基酸等代謝之外，可能還與調(diào)節(jié)甲基代謝、調(diào)整某些細胞信號識別有關。2、肝豆靈所涉及的代謝物較多，這與中藥方劑的多靶點調(diào)節(jié)或許有關。相對于青霉胺組，肝豆靈組的不同主要體現(xiàn)在精氨酸水平降低，3-羥基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸水平升高。綜合肝豆靈對精氨酸、谷氨酰胺水平的調(diào)節(jié)，可能提示其對鳥氨酸循環(huán)的恢復起到一定的促進作用。3-羥基丁酸可促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元［13］，能不同程度的抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡、促進其生長，是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能量源之一［14］。神經(jīng)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元具有支持、保護、營養(yǎng)和修復等作用，對神經(jīng)系統(tǒng)的生理起著十分重要的作用。

異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸為支鏈氨基酸，它們可保護肝臟［15］、維持神經(jīng)系統(tǒng)生化功能，促進受損神經(jīng)再生［16］，有助于恢復認知和記憶力障礙［17-18］。異亮氨酸可促進細胞生長，它和亮氨酸還是重要的營養(yǎng)劑，具有促進蛋白質(zhì)合成、提高免疫力等生理功能［19］。模型組和青霉胺組均無支鏈氨基酸、3-羥基丁酸的變化，因此我們推測，肝豆靈有可能具有補充或者調(diào)節(jié)這四種氨基酸代謝的作用。綜合以上分析，肝豆靈在恢復銅負荷大鼠小分子代謝的同時，可能還通過調(diào)節(jié)鳥氨酸循環(huán)、支鏈氨基酸、3-羥基丁酸的代謝，干預銅沉積所造成的大鼠肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。此結(jié)果與肝豆靈片可改善WD患者神經(jīng)功能、保肝等臨床研究結(jié)論［1-2］相吻合，或可初步解釋此臨床治療機制。

本實驗運用NMR代謝組學技術(shù)對青霉胺和肝豆靈片干預銅負荷大鼠進行了比較和分析，發(fā)現(xiàn)青霉胺和肝豆靈片的排銅機制具有異同點，可為以后對WD的研究和治療提供一定的參考。

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作者簡介：蔣懷周（1978—），女，博士，講師，從事中醫(yī)教學工作。Te1：（0551）65169165，E-mai1：jhz1inda@hotmai1.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助（81202691）；安徽省高校自然科學基金重點項目（KJ2012Z228）；安徽省高校博士后崗位項目（2013年）

收稿日期：2015-06-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.003

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0012-07