陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠黏附、侵襲病理機(jī)制影響的探討*

鄔素珍，趙春梅，聶潤球

(佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院婦科，廣東佛山 528000)

陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠黏附、侵襲病理機(jī)制影響的探討*

鄔素珍，趙春梅，聶潤球

(佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院婦科，廣東佛山 528000)

目的:觀察陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)大鼠血清可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1)濃度和異位內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)表達(dá)的影響。方法:建立大鼠EMs模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為陳氏內(nèi)異丸高、中、低劑量組和丹那唑、模型對照、假手術(shù)組，末次給藥1周后采血檢測。結(jié)果:陳氏內(nèi)異丸能有效降低EMs大鼠血清sICAM-1濃度，抑制異位內(nèi)膜組織MMP-3的陽性表達(dá)。結(jié)論:抑制異位內(nèi)膜的黏附、侵襲最終抑制EMs的發(fā)展，可能是陳氏內(nèi)異丸治療EMs的作用機(jī)理之一。

子宮內(nèi)膜異位癥;陳氏內(nèi)異丸;大鼠;黏附分子-1;基質(zhì)金屬蛋白酶-3

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是具有侵襲性的良性病變，體外研究表明，脫落的子宮內(nèi)膜細(xì)胞于24 h之內(nèi)即黏附于腹膜上，進(jìn)一步發(fā)生種植、侵襲形成異位病灶［1］?？扇苄约?xì)胞間黏附分子(sICAM)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是與細(xì)胞黏附、侵襲性生長機(jī)制密切相關(guān)的2種因子。本研究以丹那唑和蒸餾水為對照，觀察陳氏內(nèi)異丸對EMs大鼠血清sICAM-1濃度和異位內(nèi)膜MMP-3表達(dá)水平的影響，探討其治療EMs的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物

健康、未孕成熟的清潔級雌性SD大鼠120只，鼠齡60～80 d，體質(zhì)量200～250 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心(許可證號 SCXK(粵)2008-0020)。

1.2 藥物

陳氏內(nèi)異丸由佛山市中醫(yī)院制劑中心提供(粵藥制字Z03140215)，臨用前磨碎，將陳氏內(nèi)異丸與蒸餾水分別配制成濃度為0.72 g/mL高劑量、0.36 g/mL中劑量、0.18 g/mL低劑量3種劑量的陳氏內(nèi)異丸溶液。丹那唑膠囊由江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H20023116)，將丹那唑膠囊內(nèi)容物與蒸餾水制成濃度為3.6 mg/mL的丹那唑混懸液，蒸餾水由佛山市中醫(yī)院制劑中心提供(批準(zhǔn)文號277179)。

1.3 主要試劑與儀器

石蠟切片機(jī)(德國 LEICA)，包埋機(jī)(日本櫻花)，脫水機(jī)(英國三頓)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)，顯微照相儀(尼康)，MMP-3相關(guān)免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。大鼠血清sICAM酶免試劑盒由大連泛邦技術(shù)開發(fā)有限公司進(jìn)口分裝。

1.4 EMs大鼠模型建立

參照雷紅［2］造模方法，本實驗造模成功率為62%。

1.4.1 造模 于大鼠動情期進(jìn)行手術(shù)，以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉滿意后備皮;下腹正中縱行切口1.5 cm，逐層開腹找到左側(cè)宮角，剪下一段長約1 cm子宮體;揭除漿膜及大部分肌層，將黏膜切割成5×5 mm2的組織;將切割好的子宮黏膜面向下覆蓋腹壁表面，以“6-0”可吸收線于四角縫合固定在腹壁黏膜上;腹腔內(nèi)注入8×103u慶大霉素后逐層關(guān)腹;術(shù)后連續(xù)3 d肌注慶大霉素0.4萬U預(yù)防感染，并用碘伏消毒傷口，繼常規(guī)飼養(yǎng)4周。假手術(shù)組動物模型制作:麻醉、備皮方法同上，剖腹后關(guān)腹，術(shù)后處理同上。

1.4.2 二次剖腹探查 造模術(shù)后4周將大鼠逐一進(jìn)行二次剖腹，探查造模情況。按前法麻醉、備皮、剖腹，檢查腹壁子宮內(nèi)膜移植物是否成活。觀察移植物體積增大，出現(xiàn)液體積聚、移植物被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管生成，部分移植物成黃色或褐色小結(jié)為造模成功。取4只肉眼證實造模成功的大鼠內(nèi)異病灶組織，以體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定送檢病理，證實移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)的生長并有分泌活動，說明造模成功。假手術(shù)組二次剖腹探查時僅行開關(guān)腹術(shù)。

1.5 分組及給藥 二次剖腹探查后4周，取造模成功大鼠50只按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組各10只，分別為陳氏內(nèi)異丸中藥高、中、低劑量組和丹那唑組及模型組。本實驗低劑量組用藥相當(dāng)于成人常規(guī)口服劑量。高、中、低劑量組按7.2、3.6、1.8 g· kg－1·d－1劑量給藥，丹那唑組按36 mg·kg－1·d－1劑量給藥，模型組和假手術(shù)組給予相同容積20 ml的蒸餾水，連續(xù)給藥4周。

1.6 標(biāo)本提取

在末次給藥1周后抽內(nèi)眥靜脈血2 ml，1000 r/ min離心10 min后取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)錂z;進(jìn)行第3次剖腹手術(shù)，剝?nèi)Ms大鼠內(nèi)異病灶組織，以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，以備檢測MMP-3在大鼠異位內(nèi)膜的表達(dá)。

1.7 MMP-3表達(dá)結(jié)果判定

子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照 Terry的標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行評分，即以陽性細(xì)胞百分率及顯色深淺的半定量評分值的和為最終評分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞百分率評分:無細(xì)胞顯色為0;＜25%細(xì)胞顯色為1;25%～50%細(xì)胞顯色為2;＞50%細(xì)胞顯色為3;顯色深淺評分:不顯色或顯色不清為0;淺黃色為1;棕黃色為2;深褐色為3。2項評分相加為染色強(qiáng)度:0～1分為陰性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

灌胃過程中共死亡7只，總死亡率為11.86%;其中中藥高劑量組死亡3只，中劑量組死亡1只，低劑量組死亡1只，丹那唑組死亡2只。

2.2 血清sICAM-1結(jié)果

表1顯示，治療后陳氏內(nèi)異丸各劑量組及丹那唑組血清sICAM-1濃度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組血清sICAM-1濃度較丹那唑組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;陳氏內(nèi)異丸各劑量組血清sICAM-1濃度與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 治療后各組sICAM-1比較(±s，ng/ml)

表1 治療后各組sICAM-1比較(±s，ng/ml)

注:與模型組比較:＊P＜0.001，與丹那唑組比較:#P＜0.01，與丹那唑組比較:△P＜0.05

?

2.3 MMP-3表達(dá)結(jié)果

表2圖1～6顯示，假手術(shù)組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈陰性表達(dá)，模型組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá);中藥高、中劑量組及丹那唑組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈陰性表達(dá);中藥低劑量組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。

表2 各組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織MMP-3表達(dá)結(jié)果

表2顯示，陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組及丹那唑組陽性強(qiáng)度低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;但低劑量組陽性強(qiáng)度與模型對照組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;高、中劑量組陽性強(qiáng)度與丹那唑組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 假手術(shù)組子宮內(nèi)膜(×200)

圖2 模型組異位內(nèi)膜(×200)

圖3 高劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖4 中劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖5 低劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖6 丹那唑組異位內(nèi)膜(×200)

3 討論

EMs自1860年首次發(fā)現(xiàn)至今其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前各種發(fā)病機(jī)制中“種植學(xué)說”仍為主要學(xué)說之一。研究表明，子宮內(nèi)膜細(xì)胞在異位種植生長時，必須具備“3A模式”，即黏附(Attachment)、侵襲(Aggression)和血管生成(Angiogenesis)3個基本環(huán)節(jié)［3-5］，以此完成逆流內(nèi)膜細(xì)胞在盆腹腔腹膜、器官和組織的種植、生長，從而形成內(nèi)異病灶。

子宮內(nèi)膜成功在異位種植的首要步驟是通過一系列位于細(xì)胞表面的細(xì)胞黏附分子及與黏附相關(guān)的途徑所介導(dǎo)的內(nèi)膜細(xì)胞與種植部位的黏附［6］。閆桂英等［7］檢測到異位灶組織ICAM-1表達(dá)明顯高于其在位內(nèi)膜和對照組。另有研究者認(rèn)為，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞表面脫落的ICAM-1在異位內(nèi)膜種植初期，在異位病灶逃避免疫監(jiān)視中起重要作用［8］。Matalliotakis等［9］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者的血清可溶性ICAM-1濃度高于正常者。Daniel等［10］也發(fā)現(xiàn)，中度到重度的內(nèi)異癥患者血漿和腹腔液中ICAM-1明顯升高。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的最重要因子，MMP-3在MMPs中尤為重要，它以酶原的形式釋放，由纖溶酶激活，不僅能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，更重要的是能激活其他MMPs的酶原形式。Cox［11］在異位癥動物實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，異位病灶中MMP-3呈過度表達(dá)，從而認(rèn)為MMP-3參與組織的侵襲和重建，促進(jìn)異位癥的發(fā)生發(fā)展。因此，異位內(nèi)膜組織中MMP-3的高表達(dá)，可能賦予異位內(nèi)膜特有的侵襲和種植的能力，是EMs發(fā)病的重要機(jī)制之一。

由此可見，血清sICAM-1濃度的高低及異位病灶MMP-3表達(dá)的強(qiáng)度可反映EMs發(fā)生發(fā)展“3A”過程的活躍程度。

中醫(yī)藥在治療子宮內(nèi)膜異位癥方面取得了顯著療效［12］。陳氏內(nèi)異丸是佛山市中醫(yī)院具有40多年臨床經(jīng)驗的中西醫(yī)結(jié)合婦科專家陳秀廉獻(xiàn)方生產(chǎn)的中成藥，已在臨床使用20多年，以活血化瘀、軟堅散結(jié)、理氣止痛、補腎固本立論組方，全方重在活血化瘀消癥。陳氏內(nèi)異丸的前期臨床研究表明［13-14］，其治療EMs有明顯的臨床療效，能顯著改善EMs患者痛經(jīng)、腰骶部不適、直腸刺激癥等癥狀。

本研究旨在進(jìn)一步探討陳氏內(nèi)異丸對EMs的作用機(jī)制，結(jié)果顯示陳氏內(nèi)異丸能有效降低EMs模型大鼠的血sICAM-1濃度，并能降至正常水平，高、中劑量組療效優(yōu)于丹那唑組(高劑量組P＜0.01，中劑量組P＜0.05);陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組能有效抑制異位病灶MMP-3的陽性表達(dá)，且與丹那唑組比較療效相當(dāng)。

綜上表明，陳氏內(nèi)異丸能明顯降低EMs大鼠血sICAM-1濃度，并能抑制 EMs大鼠異位病灶中MMP-3的陽性表達(dá)，高、中劑量組療效尤其顯著。因此，陳氏內(nèi)異丸可降低異位病灶活性并有效治療EMs，其作用機(jī)制可能與通過免疫調(diào)節(jié)、抑制異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、種植而達(dá)到清除異位病灶的作用有重要的關(guān)系。這一實驗結(jié)果為臨床使用陳氏內(nèi)異丸治療EMs提供了有力的依據(jù)。

［1］Michelle Nisolle MD，F(xiàn)rancoise Casanas Roux BS．Jacques Donnea MDP．Short term culture of peritoneam explants．Confirmsattachmentofendometrium to intact peritoneal mesothelium［J］．Fertil Steril，2000，74:306-312．

［2］雷紅，熊世熙，曹萍．轉(zhuǎn)化生長因子與糖尿病性心肌病關(guān)系的實驗研究［J］．中國糖尿病雜志，2002，10(1):11-14．

［3］Bruner-Tran KL，Osteen KG，Taylor HS，et al．Resveratrol inhibits development of experimental endometriosis in vivo and reduces endometrial stromal cell invasiveness in vitro［J］．Biol Reprod，2011，84(1):106-112．

［4］Bodden-Heidrich R．Chronic pelvic pain syndromea multifactorial syndrome［J］．Zentralbl Gynakol，2001，123(1):10-17．

［5］García Manero M，Olartecoechea B，Aubá M，et al．Angiogenesis and endometriosis［J］．Rev Med Univ Navarra，2009，53(2):8-13．

［6］羅曼，李紅發(fā)．酪氨酸激酶受體c-kit和細(xì)胞間黏附分子－1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(11):1571-1574．

［7］閆桂英，鄭慕白，章漢旺，等．細(xì)胞間黏附分子21在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、腹腔液及異位灶中的表達(dá)及分析〔J〕．實用婦產(chǎn)科雜志，2005，21(3):158-160．

［8］Dan I，Lebovic MD，Mueller MD，etal．Immunobiologyof endometriosis［J］．Fertil Steril，2001，75:1-10．

［9］Matalliotakis IM，Vassiliadis S，Goumenou AG，et al．Soluble ICAM-1 levels in the serum of endometriotic patients appear tobe independent of medical treatment［J］．J Reprod Immunol，2001，51(1):9-19．

［10］Daniel Y，Geva E，Amit A，et al．Do soluble cell adhesion molecules play a role in endometriosis Am J Reprod Immuno，2000，43(3):160-166．［11］Cox KE，Piva M．Kath Lyetal Differential regulation of matrix metalloproteinase-3 gene expression in endometriotic lesions compared with endometrium［J］．BiolReprod，2001，65(4):1297-1303．

［12］謝麗麗．中醫(yī)藥防治子宮內(nèi)膜異位癥實驗研究進(jìn)展〔J〕．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32(6):835．

［13］鄔素珍，陳秀廉，鄧衛(wèi)紅，等．內(nèi)異丸合內(nèi)異灌腸液聯(lián)合治療子宮內(nèi)膜異位癥的臨床觀察〔J〕．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，23(3):198．

［14］鄔素珍，陳秀廉，黃月嬋，等．內(nèi)異丸合內(nèi)異灌腸液聯(lián)合治療子宮內(nèi)膜異位癥療效觀察〔J〕．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(6):557．

Investigation of Chenshi Neiyi Pill to the Adhesion，Invasion and Pathological Mechanism of Endometriosis Rats

WU Su-zhen，ZHAO Chun-mei，NIE Run-qiu
(Chancheng District Central Hospital of Foshan city，F(xiàn)oshan，Guangdong 528000，China)

Objective:To evaluate the effect of NeiYi Pill of Chen by the ICAM-1 concentration and expression of MMP-3 on endometriosis model in rats．Methods:To establish endometriosis model in rats．Results:NeiYi Pill of Chen can decrease the ICAM-1 concentration of endometriosis model in rats effectively．Conclusion:Inhibiting the adhesion and invasion of ectopic endometrium，eventually inhibiting the EMS development，may be one of NeiYi Pill of Chen theatment EMS mechanism of action．

Endometriosis;NeiYi Pill of chen;Rat;ICAM-1;MMP-3

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0073-03

2015-04-16

廣東省中醫(yī)藥管理局基金項目(1060007)-陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥作用機(jī)制的實驗研究

鄔素珍(1965-)，女，廣東興寧人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，碩士研究生導(dǎo)師，從事子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥的臨床與研究。