綠色絲膠蛋白質(zhì)功能特性研究

葉崇軍 耿 齊 李 冰 陳復(fù)生

(1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061; 2南京蘇豪絲綢文化發(fā)展有限公司，江蘇南京 210005)

綠色絲膠蛋白質(zhì)功能特性研究

葉崇軍1耿 齊2李 冰1陳復(fù)生1

(1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061;2南京蘇豪絲綢文化發(fā)展有限公司，江蘇南京 210005)

以選配的純絲膠蠶品種組合(綠S、白S)生產(chǎn)的全天然綠色純絲膠蠶繭、白色純絲膠蠶繭以及現(xiàn)行蠶品種菁松×皓月(JS)生產(chǎn)的白色普通蠶繭、遠(yuǎn)緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的黃色普通蠶繭、遠(yuǎn)緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的白色普通蠶繭為材料，對綠色絲膠蛋白質(zhì)的部分功能特性進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，綠S蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)抗氧化能力最強(qiáng);在絲膠蛋白濃度為1 mg/mL時(shí)，綠S蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)比JS蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉的抑菌圈直徑分別大2.5、3.1、1.5、1.7、2.3、1.5 mm;在315～500 nm的波域內(nèi)，綠S蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)仍然具有較強(qiáng)的紫外吸收能力，表明其具有更為優(yōu)異的抗氧化、抗菌、紫外線遮蔽等功能特性，該結(jié)果為綠色絲膠蛋白在化妝品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)提供了依據(jù)。

絲膠蛋白質(zhì);純絲膠蠶繭;抗氧化性;抗菌性能;紫外吸收光譜;功能特性

絲膠蛋白質(zhì)為水溶性球狀蛋白質(zhì)，是化妝、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)的優(yōu)良材料，其利用的價(jià)值在于具有諸多獨(dú)特的、有用的功能特性［1］。

蠶繭顏色由桑葉中的胡蘿卜色素和類黃酮色素決定［2］。桑葉中含有的類黃酮色素在蠶體內(nèi)透過腸壁并運(yùn)輸?shù)侥c腔細(xì)胞、體液、絲腺細(xì)胞，在絲腺中分泌合成有色絲膠蛋白質(zhì)，形成彩色蠶繭，家蠶繭絲的色澤多由絲膠蛋白質(zhì)的色澤決定［3］。我們以選配的純絲膠蠶品種組合所生產(chǎn)的天然綠色純絲膠蠶繭為材料，對有色絲膠蛋白質(zhì)的部分功能特性開展研究，旨在為應(yīng)用有色絲膠蛋白質(zhì)在化妝、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域的創(chuàng)新產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器 LGJ－12型冷凍真空干燥儀，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;氨基酸自動分析檢測儀，德國SYKAM公司產(chǎn)品;UV－1201型紫外熒光光度計(jì)，北京北分瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;Re－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;SYQ· STX－280型手提式高壓蒸汽消毒鍋，杭州華創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HG101－2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，蘇州貫覺電熱設(shè)備有限公司產(chǎn)品;PYX－DHS－40× 50型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，杭州匯爾儀器有限公司產(chǎn)品;PB602N型電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品;ZH－WY－111B型恒溫培養(yǎng)搖床，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 鄰苯三酚、水楊酸乙醇，均為分析純(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;風(fēng)味蛋白酶，分析純(AR)，上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 供試蠶繭 從日本引進(jìn)的純絲膠種質(zhì)資源與綠色蠶繭蠶品種組配的品種組合(綠S)生產(chǎn)的綠色純絲膠蠶繭，從日本引進(jìn)的純絲膠種質(zhì)資源與白色蠶繭蠶品種組配的品種組合(白S)生產(chǎn)的白色純絲膠蠶繭，現(xiàn)行生產(chǎn)用蠶品種菁松×皓月(JS)生產(chǎn)的白色普通蠶繭，遠(yuǎn)緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的黃色普通蠶繭，遠(yuǎn)緣雜交的蠶品種生產(chǎn)的白色普通蠶繭(遠(yuǎn)緣雜交普通黃色繭、遠(yuǎn)緣雜交普通白色繭是以安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所桑園野蠶與家蠶品種“若玉”雜交所選育品系生產(chǎn)的蠶繭)，均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供。

1.1.4 供試菌種 大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉均由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)系提供。

1.1.5 供試培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基、枯草桿菌培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基、米曲霉培養(yǎng)基、黑曲霉培養(yǎng)基，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白樣品的制備將綠S蠶繭和白S蠶繭用手撕剝離繭殼倒出蠶蛹，JS蠶繭、遠(yuǎn)緣雜交普通黃色繭、遠(yuǎn)緣雜交普通白色繭用削繭刀削繭倒出蠶蛹，分別去除粘附在5種蠶繭上的贓物，然后用30℃水分別洗滌倒出蠶蛹后的5種蠶繭繭殼，洗滌后的5種蠶繭繭殼分別于60℃烘干5 min，然后分別剪成2 mm×2 mm的蠶繭繭殼碎片。分別稱取5 g綠S蠶繭、白S蠶繭和JS蠶繭、遠(yuǎn)緣雜交普通黃色蠶繭和遠(yuǎn)緣雜交普通白色蠶繭的繭殼碎片，分別放入500 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水250 mL，放入SYQ·STX－280型手提式高壓蒸汽消毒鍋中在125℃高壓下蒸煮2.5 h，待5種繭殼的蒸煮液完全冷卻后取出分別用紗布過濾，過濾出的生絲再用30℃的溫水洗滌3遍，將蠶絲脫膠液和對應(yīng)的洗滌液合并，然后用濾紙抽濾，分別將5種絲膠溶液在80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約100 mL，所得絲膠液體在冷凍干燥機(jī)的冷凍盤中自然冷卻至室溫后再轉(zhuǎn)入－40℃條件下冷凍2 h，然后放入冷凍干燥儀，在樣品溫度－33℃、1 Pa條件下干燥。獲得綠S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、白S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、JS普通蠶繭絲膠蛋白粉、遠(yuǎn)緣雜交普通黃色蠶繭絲膠蛋白粉及遠(yuǎn)緣雜交普通白色蠶繭絲膠蛋白粉樣品，在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)含量測定與氨基酸組成分析 按照文獻(xiàn)［4］的凱式定氮方法進(jìn)行。以1.2.1獲得的綠S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉、白S純絲膠蠶繭絲膠蛋白粉及JS普通蠶繭絲膠蛋白粉，操作參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定方法》［5］進(jìn)行。測定結(jié)果根據(jù)下面的公式［5］計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，用Microsoft Excel軟件制作柱式圖。

［式中X為蛋白質(zhì)含量(%)，V1為樣品消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)，V2為試劑空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)，N為硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾質(zhì)量濃度(mol/L)，0.014為 0.5 mol/L硫酸或1 mol/L HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL相當(dāng)于氮的克數(shù)，m為樣品的質(zhì)量(g)，F(xiàn)為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。］

表1 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白粉的蛋白質(zhì)含量

1.2.3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)抗氧化性的測定 利用吸光值測定，計(jì)算羥基自由基、超氧自由基的清除能力，操作按照陳復(fù)生等［6］的方法進(jìn)行。在風(fēng)味酶濃度4 mg/mL、pH7.0、反應(yīng)溫度60℃、底物濃度10 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間120 min的條件下水解絲膠蛋白質(zhì)，將絲膠蛋白質(zhì)水解液在波長536 nm條件下檢測吸光度，所得結(jié)果根據(jù)下面的公式計(jì)算出羥基自由基的去除率;再將絲膠蛋白質(zhì)水解液在100℃條件下滅活10 min，將滅活后的絲膠蛋白質(zhì)水解液在波長536 nm條件下檢測吸光度，所得結(jié)果根據(jù)下面的公式計(jì)算出超氧自由基去除率。

羥基自由基(超氧自由基)去除率(%)=［A3－(A1－A2)］/A3×100［式中A1為對照不加樣品的吸光度;A2為某濃度時(shí)的吸光度;A3為無顯色劑時(shí)的該濃度的吸光度本底值。］

1.2.4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)抗菌性能的測定 操作按照李冰等［7］的方法進(jìn)行，將定性濾紙于HG101－2型電熱鼓風(fēng)干燥箱中在80℃下干熱滅菌4 h后，分別將滅菌后的濾紙片浸入蛋白質(zhì)含量為1、10、100 mg/mL濃度的3種絲膠蛋白質(zhì)溶液中泡30 min后取出晾干備用。分別將大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉菌菌種在超凈工作臺里無菌操作接種到盛有對應(yīng)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(或試管)中，接種好后大腸桿菌在37℃培養(yǎng)6 h、枯草桿菌在37℃培養(yǎng)4 h、金黃色葡萄球菌在37℃培養(yǎng)24 h、酵母菌在25℃培養(yǎng)48 h、米曲霉在30℃培養(yǎng)72 h、黑曲霉在37℃培養(yǎng)5 h。用接種環(huán)將預(yù)先接種培養(yǎng)好的各種菌種的菌落輕刮下來置于盛有10 mL雙蒸水的離心管中，將盛有各種菌種的菌落刮落液置旋渦混合器中充分混勻。用200 μL規(guī)格的移液槍分別吸取0.1 mL各種菌懸液均勻涂布在預(yù)先澆制好的對應(yīng)的平板培養(yǎng)基上，靜置5 min左右。將濾紙片按絲膠溶液濃度成正三角形放在涂布有各種菌懸液的各平板培養(yǎng)基表面，平板培養(yǎng)基中間以貼上浸有相應(yīng)水溶液浸泡過的濾紙片作為空白對照，細(xì)菌在36℃左右，恒溫培養(yǎng)24 h，真菌在28℃左右恒溫培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜分析 操作按照陳復(fù)生［8］的方法進(jìn)行。分別用雙蒸水將不同樣本的絲膠蛋白質(zhì)配制成5 mg/mL的絲膠蛋白質(zhì)溶液，室溫下磁力棒低速攪拌1 h，使溶液分散均勻，將不同樣本的絲膠蛋白質(zhì)溶液(5 mg/mL)置于190～500 nm波段的紫外分光光度計(jì)下測定吸收光譜，根據(jù)吸收光譜曲線，判斷絲膠蛋白紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種蠶繭繭殼中絲膠蛋白質(zhì)含量與氨基酸組成分析

由圖1可見，絲膠蛋白質(zhì)含量以白S純絲膠蠶繭繭殼的最高，達(dá)到92.25%，其次是綠S純絲膠蠶繭繭殼，達(dá)到91.27%，如加上溫水洗滌蠶繭繭殼的絲膠損失部分，純絲膠繭繭殼的絲膠蛋白質(zhì)含量將更高。而現(xiàn)行家蠶品種JS蠶繭繭殼的絲膠蛋白質(zhì)含量僅為25.03%。表明純絲膠蠶繭蠶品種綠S和白S生產(chǎn)的為全天然純絲膠蛋白質(zhì)蠶繭。

圖1 不同品種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質(zhì)含量

由表2知，3種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質(zhì)的氨基酸成分中絲氨酸(Ser)的含量分別為綠S 36.865 0%、白S 34.688 7%、JS 30.939 8%，綠 S達(dá)到36%以上;甘氨酸(Gly)的含量分別為綠S 15.021 0%、白S 15.665 5%、JS 14.574 0%，綠S達(dá)到15%以上;絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合計(jì)含量分別為綠 S 51.886 0%、白S 50.354 2%、JS 45.513 8%，綠S絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合計(jì)含量占到絲膠蛋白質(zhì)的氨基酸組成的51%以上;絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以綠S含量最高。

表2 不同品種蠶繭繭殼的絲膠蛋白質(zhì)的氨基酸組成 %

2.2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的抗氧化活性分析

圖2 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)清除羥基自由基的效果

由圖2－3可見，天然純絲膠蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)清除羥基自由基和清除超氧自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于普通蠶繭的絲膠蛋白質(zhì);不同顏色蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)清除羥基自由基和清除超氧自由基能力的順序依次為綠S＞白S＞遠(yuǎn)緣雜交普通黃色繭＞遠(yuǎn)緣雜交普通白色繭＞JS;綠S的絲膠蛋白質(zhì)抗氧化能力最強(qiáng)。

圖3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)清除超氧自由基的效果

2.3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

由不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜(圖4)可見，在絲膠蛋白質(zhì)濃度為0.5%時(shí)，綠S、白S、JS在190～252 nm均出現(xiàn)2個吸收峰，都具有很強(qiáng)的吸收能力。但在其后白S、JS蛋白質(zhì)的紫外吸收趨勢迅速降低，而綠S蛋白質(zhì)的紫外吸收趨勢減緩，尤其在315～500 nm的波域內(nèi)，綠S蛋白質(zhì)的紫外吸收仍然具有較強(qiáng)的能力。

圖4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

2.4 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的抗菌能力

由表3和圖5可看出，不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)對大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌均具有較強(qiáng)的抗菌能力，抗菌能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)榫GS＞白S＞JS。

表3 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)對供試菌的抑菌效果

圖5 不同品種蠶繭繭殼絲膠蛋白質(zhì)的抗菌能力

3 小結(jié)與討論

天然絲膠蛋白質(zhì)作為化妝、保健、醫(yī)藥創(chuàng)新產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料，已引起人們的廣泛關(guān)注，其利用價(jià)值在于其具有諸多獨(dú)特的、有用的功能特性［1］。

有色繭絲蛋白質(zhì)的生成是蠶食下的桑葉中含有的胡蘿卜色素和類黃酮色素在蠶體內(nèi)由一系列的遺傳基因控制，透過并運(yùn)輸?shù)侥c腔細(xì)胞、體液、絲腺細(xì)胞，在絲腺中合成和分泌有色絲膠蛋白質(zhì)，形成有色蠶繭［2］。有色繭絲的色澤多集中于蠶繭外層的絲膠上。

本試驗(yàn)以品種組合生產(chǎn)的天然純絲膠蠶繭溶解提取的絲膠蛋白質(zhì)與普通蠶繭溶解提取的絲膠蛋白質(zhì)為材料，對其部分主要功能特性進(jìn)行了試驗(yàn)比較，純絲膠蠶繭絲膠溶解提取的絲膠蛋白質(zhì)顯示出在含量、抗氧化、防紫外線、抗菌等方面具有優(yōu)良功能特性，而綠色純絲膠蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)的這些功能特性更為優(yōu)秀。試驗(yàn)結(jié)果表明，綠色純絲膠品種組合生產(chǎn)的天然、純粹、無變性蠶繭可直接溶解提取的絲膠蛋白質(zhì)，更具廣泛的利用價(jià)值，作為原料在化妝品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的產(chǎn)品創(chuàng)新具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)中凱式定氮方法調(diào)查的不同蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)含量，純絲膠蠶繭繭殼遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通蠶繭繭殼，綠色純絲膠蠶繭繭殼稍低于白色純絲膠蠶繭繭殼;絲膠蛋白質(zhì)的氨基酸成分中絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以綠S含量最高。推測蠶繭的絲膠蛋白質(zhì)含量及絲膠蛋白質(zhì)氨基酸組成對其功能特性有一定的影響，原因有待進(jìn)一步的深入研究。

本試驗(yàn)只對部分有色蠶繭絲膠蛋白質(zhì)的功能特性作了探討，其他相當(dāng)多的功能特性如化妝品的乳化性、濕潤性、吸放濕性、粘合和分散性等，保健食品的渾濁度、色澤、風(fēng)味、爽滑感等，與醫(yī)藥歸納為物質(zhì)的結(jié)合等功能特性有待于進(jìn)一步的深入研究。

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S881.3

A

1007－0982(2016)04－0050－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.012

2016－06－29;接受日期:2016－09－30

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號1608085MC75);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號 CARS－22);安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子工程項(xiàng)目(編號15B0605)。

第1作者信息:葉崇軍(1983—)，男，安徽六安，碩士，助理研究員。Tel:0551－2852900，E-mail:yechj1983@163.com

信息:陳復(fù)生(1958—)，男，安徽全椒，博士，研究員。Tel:0551－2852900，E-mail:chenfs58@163.com