梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性及胚種傳染性研究

陳世良 高建華 陳海佺 黎永謀 鄧 歡 高 翔 朱 峰

(云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性及胚種傳染性研究

陳世良 高建華 陳海佺 黎永謀 鄧 歡 高 翔 朱 峰

(云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

通過人工添食的方法，用不同保存條件下的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染家蠶4齡起蠶，以確定梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性、胚種傳染性以及食下感染率、胚種傳染率的差異。試驗結(jié)果表明，梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶具有很強的感染性和胚種傳染性。以梨花遷粉蝶體中新鮮微孢子蟲的食下感染率最高，為89.2%;以蛾體形式保存在4℃冰箱中半年的微孢子蟲食下感染率次之，為84.8%;以蛾體形式保存在自然環(huán)境中半年的微孢子蟲食下感染率較低，為13.3%;以微孢子蟲水溶液形態(tài)保存于4℃冰箱中半年的食下感染率最低，為3.4%。家蠶轉(zhuǎn)青卵檢驗胚種傳染率，以梨花遷粉蝶體中新鮮微孢子蟲的最高，為25.3%;4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶體中微孢子蟲的次之，為19.3%;自然環(huán)境中存放半年梨花遷粉蝶體中微孢子蟲的較低，為18.7%;以微孢子蟲水溶液形態(tài)保存于4℃冰箱中半年梨花遷粉蝶微孢子蟲的最低，為11.3%。

家蠶;梨花遷粉蝶;微孢子蟲;保存形式;感染性;胚種傳染性

目前關于其對家蠶感染性的研究幾乎是空白。為了弄清楚該微孢子蟲在新鮮狀態(tài)和以不同條件保存半年后對家蠶的感染性及胚種傳染性，為家蠶微粒子病的病原檢測和病害防治提供依據(jù)，我們在2007年預備試驗的基礎上，2015年以來通過人工添食的方法，利用不同保存條件下的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性進行試驗，以確定梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性、胚種傳染性以及食下感染率、胚種傳染率的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 梨花遷粉蝶微孢子蟲病原體 通過捕捉云南省蒙自市田間地頭飛翔的梨花遷粉蝶，經(jīng)鏡檢確定后得到并保存。

1.1.2 供試家蠶品種 932·芙蓉，云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所保存提供，正常催青飼養(yǎng)至4齡起蠶供試。

1.1.3 主要儀器設備 尼康YS100生物顯微鏡，上海中恒儀器有限公司產(chǎn)品;KDC－170型離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司產(chǎn)品;血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑有限公司產(chǎn)品;移液槍，上海生物工程有限公司產(chǎn)品;乳缽、乳棒、滴管、排筆均為市售產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 梨花遷粉蝶微孢子蟲病原體的收集鑒定與處理 于2015年早秋，在云南省蒙自地區(qū)田間地頭通過人工捕捉的方式共捕捉到了飛翔的梨花遷粉蝶60只，分別將捕捉到的每只梨花遷粉蝶剪下翅膀進行研磨，將研磨液用尼康YS100生物顯微鏡進行鏡檢，得到確定有微孢子蟲的梨花遷粉蝶31只，對確定有梨花遷粉蝶微孢子蟲的31只梨花遷粉蝶分別作如下處理:(1)7只梨花遷粉蝶以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中保存半年;(2)7只梨花遷粉蝶以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中保存半年;(3)17只梨花遷粉蝶經(jīng)過研磨、過濾、離心、純化，收集新鮮裸孢子，將收集到的新鮮裸孢子液分成2份，一份馬上用于對4齡家蠶進行新鮮裸孢子添食、一份以水溶液形態(tài)于4℃冰箱中保存半年，到2016年春用于對4齡家蠶進行裸孢子添食試驗。(4)從收集到的新鮮裸孢子液中取少部分微孢子蟲樣品委托重慶師范大學生命科學學院進行分子生物學鑒定。添食試驗分2次進行，第1次是(2015年8月)利用從剛捕捉到的梨花遷粉蝶體內(nèi)收集到的新鮮裸微孢子蟲液對4齡家蠶起蠶進行添食，第2次是(2016年3月)以不同狀態(tài)存放半年后的梨花遷粉蝶微孢子蟲對4齡家蠶起蠶進行添食。

1.2.2 病原體制備 (1)于2015年8月將1.2.1項(3)得到的新鮮的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲液，配制成濃度為 1.98×107個/mL的孢子液。(2)于2016年3月用以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中存放和以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的2種梨花遷粉蝶體內(nèi)的微孢子蟲及以微孢子蟲水溶液形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的裸微孢子蟲，前2種保存形式的微孢子蟲在添食前先對蛾體進行研磨、過濾、離心、純化制成微孢子蟲液。添食時統(tǒng)一將純化的梨化遷粉蝶微孢子蟲配制成濃度為1.98×107個/mL的微孢子蟲液;同時給4齡起蠶進行添食。

1.2.3 家蠶分區(qū)和梨花遷粉蝶微孢子蟲的添食(1)于2015年8月10日用新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲對200頭4齡起蠶進行添食，同時以不添食病原物為空白對照。用移液槍吸取制得的新鮮的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲液(孢子濃度為1.98×107個/mL) 1 mL，均勻地涂抹在1片大小為240～250 cm2的桑葉的正反兩面上，共涂抹桑葉4片，晾干后飼喂4齡起蠶，待蠶基本吃完帶毒葉后換普通桑葉常規(guī)飼養(yǎng)，每日給桑3次，并全程飼喂經(jīng)過清洗的桑葉。飼育至蠶結(jié)繭化蛾，對蠶蛾逐頭鏡檢，調(diào)查蠶蛾發(fā)病情況。(2)于2016年3月15日將4齡起蠶分成4區(qū)，每區(qū)數(shù)蠶200頭，分別添食以上3種保存形式(以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中存放半年和以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的2種梨花遷粉蝶體內(nèi)的微孢子蟲及以孢子水溶液形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的裸微孢子蟲)的微孢子蟲，以不添食病原物為空白對照。用移液槍分別吸取不同保存形式制得的梨花遷粉蝶微孢子蟲液(孢子濃度為1.98×107個/mL)1 mL，均勻地涂抹在1片大小為240～250 cm2的桑葉的正反兩面上，每個處理區(qū)涂抹桑葉4片，晾干后每個處理區(qū)分別給予對應的帶毒葉4片飼喂4齡起蠶，待蠶基本吃完帶毒葉后換普通桑葉常規(guī)飼養(yǎng)，每日給桑3次，并全程飼喂經(jīng)過清洗的桑葉。飼育至蠶結(jié)繭化蛾，對蠶蛾逐頭鏡檢，調(diào)查蠶蛾發(fā)病情況。

或許因為是冬天，讓人感覺到靜逸和冷涼。這是一所怎樣的學校，期待的落差漸漸強烈，心里嘀咕廣藝外學院怎么選擇這樣的一所學校，值得我們名師來參觀嗎？

1.2.4 感染梨花遷粉蝶微孢子蟲的家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的患病情況 將羽化后的家蠶母蛾，分別與健康的雄蛾(空白對照未添食微孢子蟲的蠶羽化的雄蛾)交配后以單蛾形式生產(chǎn)部分蠶種，進行即時浸酸處理。添食梨花遷粉蝶微孢子蟲后感染梨花遷粉蝶微孢子蟲的家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵，經(jīng)過母蛾檢驗，留下感病母蛾所產(chǎn)的卵圈，將感病母蛾所產(chǎn)的卵圈催青后分別對轉(zhuǎn)青卵、蟻蠶、卵殼進行顯微鏡檢驗。轉(zhuǎn)青卵以粒為單位逐粒檢驗，蟻蠶、卵殼以卵圈為單位進行集團檢驗，檢查轉(zhuǎn)青卵、蟻蠶、卵殼的帶毒情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試梨花遷粉蝶微孢子蟲的病原鑒定結(jié)果

委托重慶師范大學生命科學學院對供試的梨花遷粉蝶微孢子蟲進行分子生物學鑒定，通過將供試的梨花遷粉蝶微孢子蟲與我們之前分離獲得的梨花遷粉蝶微孢子蟲Nosema sp.CP的克隆序列進行兩兩比較，結(jié)果顯示它們在核糖體16s rDNA序列之間高度相似，相似度在99.0%以上，確定了該微孢子蟲與鄭麗金等［11］報道的梨花遷粉蝶微孢子蟲為同一物種(圖1－2)。

圖1 梨花遷粉蝶

圖2 梨花遷粉蝶微孢子蟲［640(16×40)倍］

2.2 家蠶幼蟲食下梨花遷粉蝶微孢子蟲后羽化的蠶蛾梨花遷粉蝶微孢子蟲感染情況

從表1可以看出:添食新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲、不同保存環(huán)境和保存狀態(tài)下的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染家蠶有很大的差異，以添食新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲的感染率最高，達到89.2%;添食以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染率稍低，為84.8%;添食以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染率較低，為13.3%;添食以微孢子蟲水溶液形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲感染率最低，只有3.4%;空白對照區(qū)感染率為0。

表1 不同保存形式梨花遷粉蝶微孢子蟲添食4齡家蠶后羽化的蠶蛾檢驗結(jié)果

2.3 感染梨花遷粉蝶微孢子蟲的家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵患病情況

從表2可以看出，通過隨機抽取各種保存形式的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染后患病母蛾所產(chǎn)下的蠶卵(轉(zhuǎn)青卵)3個卵圈各100粒進行單粒卵鏡檢，結(jié)果梨花遷粉蝶體中新鮮微孢子蟲、以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲、以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲、以微孢子蟲水溶液形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲4種保存形式添食家蠶的母蛾所產(chǎn)的蠶卵都有帶病卵，病卵率在11.3%～25.3%之間，平均為18.7%，其中添食新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的病卵率最高為25.3%，添食以微孢子蟲水溶液形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的病卵率最低為11.3%，添食以蛾體形態(tài)在自然環(huán)境中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的病卵率和添食以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中存放半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的病卵率相差不大，分別為18.7%和19.3%。對其病蛾所產(chǎn)的卵經(jīng)催青孵化后的蟻蠶、卵殼分別以卵圈為單位進行檢驗，結(jié)果整個卵圈蟻蠶集團檢驗檢出率在89.3%～100%之間，平均為95.3%;卵殼集團檢驗檢出率在88.9%～96.4%之間，平均為93.0%，表明同一卵圈，無論是蟻蠶或是卵殼，都有檢驗到微孢子蟲孢子的可能。

表2 不同保存形式梨花遷粉蝶微孢子蟲感染家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵的轉(zhuǎn)青卵、蟻蠶、卵殼的檢驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

從梨花遷粉蝶新鮮微孢子蟲和3種不同保存形式存放了半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性添食試驗結(jié)果可知，新鮮的梨花遷粉蝶微孢子蟲和以蛾體的形態(tài)在4℃冰箱中保存半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶均有很高的感染率，這2種保存形式有利于保持梨花遷粉蝶微孢子蟲的活性。

梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶具有感染性和胚種傳染性，但是添食不同存放環(huán)境和存放形式的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染有差異，以添食新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲的感染率最高，添食以蛾體形態(tài)在4℃冰箱中保存半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲的感染率次之，添食以蛾體形式保存在自然環(huán)境中半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染率較低，添食以微孢子蟲水溶液形態(tài)在4℃冰箱中保存半年的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲感染率最低。與新鮮梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染率為89.2%相比，以蛾體形式在4℃冰箱中保存半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染率、以蛾體形式保存在自然環(huán)境中半年的梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染率、以水溶液形態(tài)在4℃冰箱中保存半年的梨花遷粉蝶裸微孢子蟲對家蠶的感染率分別下降了4.4、75.9、85.8個百分點。同時還可以看出，只要家蠶母蛾感病，其所產(chǎn)的蠶卵不論是在轉(zhuǎn)青卵、蟻蠶、卵殼中都可以檢驗到一定數(shù)量的微孢子蟲，雖然4種保存形式的梨花遷粉蝶微孢子蟲試驗調(diào)查結(jié)果在一定的范圍內(nèi)有開差，但足以證明梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶具有一定的胚種傳染性。從不同存放形式的梨花遷粉蝶微孢子蟲感染家蠶母蛾所產(chǎn)蠶卵(轉(zhuǎn)青卵)的微孢子蟲的檢驗結(jié)果看，平均有18.7%的蠶卵胚胎中檢查到微孢子蟲。由試驗結(jié)果可知，梨花遷粉蝶微孢子蟲對家蠶的胚種傳染率比家蠶微孢子蟲低，但又比菜粉蝶微孢子蟲對家蠶的胚種傳染率(4.55%～5.07%)高［12－13］。

微粒子病對蠶業(yè)生產(chǎn)的危害是非常大的，家蠶除食下感染外，胚種傳染也是一個重要的原因，故在各級蠶種繁育過程中，防治微粒子病除加強對母蛾檢疫外，對蠶種實施“補正檢查”［1，14］也是很有必要的，它確保了從源頭上對微粒子病的預防和控制，杜絕胚種傳染對蠶業(yè)生產(chǎn)的危害。此外，加強桑園病蟲害和野外昆蟲的防治，殺滅微孢子蟲的寄主和中間宿主，切斷野外昆蟲微孢子蟲交叉感染家蠶［15－16］，是綜合防治家蠶微粒子病的重要措施。

［1］沈中元，萬永繼，魯興萌，等.家蠶微粒子病綜合防治技術［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2015:4－19.

［2］楊瓊，徐興耀，盧鏗明，等.感染菜粉蝶的兩種微孢子蟲的研究(I)病原形態(tài)及對家蠶的病原性［J］.廣東蠶業(yè)，2001，35(2): 16－19.

［3］孫勝，宗浩，楊小蓉.家蠶微孢子(Nosema bombycis)對菜青蟲(Pierisrapae)的感染與致病性研究［J］.四川師范大學學報:自然科學版，2001，24(1):69－71.

［4］廖森泰，方定堅，鄭祥明，等.藍葉甲微孢子蟲的特性及其對家蠶病原性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，1992，13(4):53.

［5］潘慧敏，崔紅娟，萬永繼，等.菜粉蝶微孢子的多樣性及對家蠶感染性的初步研究［J］.四川蠶業(yè)，1999，27(3):10－11.

［6］亞明，朱阿華.怎樣防止野外鱗翅目昆蟲與家蠶微粒子病的交叉?zhèn)魅荆跩］.廣西蠶業(yè)，2003，40(2):23－26.

［7］張麗霞，周雙云，張遠輝.遷粉蝶嚴重危害決明屬植物［J］.植物保護，2003，29(1):60.

［8］張?zhí)鞚?，尚素琴，張雅林，?中國遷粉蝶屬分類研究［J］.昆蟲分類學報，2009，31(1):34－44.

［9］汪江，尚素琴，張雅林.中國遷粉蝶屬(鱗翅目，粉蝶科)基于NDⅠ和COⅠ基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育關系［J］.動物分類學報，2010，5(4):776－781. ［10］陳燕婷，吳珍泉，陳偉.梨花遷粉蝶成蟲的產(chǎn)卵行為［J］.生物安全學報，2013，22(3):212－214.

［11］鄭麗金，陳世良，馬振剛，等.從梨花遷粉蝶中所得微孢子蟲的系統(tǒng)進化分析［J］.重慶師范大學學報:自然科學版，2014，31 (5):42－47.

［12］陳世良，高翔，張全祥，等.云南菜粉蝶微孢子蟲感染家蠶的病原性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2015，28(2):913－917.

［13］陳世良，楊榮貴，高建華，等.菜粉蝶微孢子蟲對家蠶胚種傳染性與蠶桑質(zhì)量影響研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43(8):241－243.

［14］馮家新.蠶種學［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1993.

［15］鄭祥明，楊瓊，方定堅，等.廣東省昆蟲微孢子蟲資源調(diào)查及交叉感染的研究［J］.蠶業(yè)科學，2003，29(4):382－383.

［16］蔣滿貴，羅梅蘭，湯慶坤，等.蠶種生產(chǎn)大環(huán)境中微孢子蟲污染情況調(diào)查分析［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學，2009，40(10):1 346－1 349.

S884.2+1

A

1007－0982(2016)04－0032－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.008

2016－05－13;接受日期:2016－09－07

云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所青年創(chuàng)新基金項目(編號QC2015001)。

第1作者信息:陳世良(1964—)，男，云南陸良，本科，副研究員。Tel:13608734908，E-mail:chenshl123@163.com

信息:朱峰(1984—)，男，山東棗莊，博士，副研究員。Tel:18287322700，E-mail:zf200537@163.com