桑枝水提物對桑黃液體發(fā)酵的影響及桑黃液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

鄒湘月 李飛鳴 邵元元 宋南平 張 仟 顏新培

(湖南省蠶?？茖W研究所，湖南長沙 410127)

桑枝水提物對桑黃液體發(fā)酵的影響及桑黃液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

鄒湘月 李飛鳴 邵元元 宋南平 張 仟 顏新培

(湖南省蠶?？茖W研究所，湖南長沙 410127)

以每100 mL發(fā)酵液生成的菌絲體生物量及其中桑黃多糖、三萜及黃酮含量為考察指標，研究液體培養(yǎng)基中添加桑枝水提物對桑黃發(fā)酵的影響，并對桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結果表明，在常規(guī)培養(yǎng)基中添加桑枝水提物對菌絲體每100 mL發(fā)酵液生成的生物量及發(fā)酵液中的有效成分的含量具有明顯的促進作用，桑黃菌株SH1501、SH1502、SH1503每100 mL發(fā)酵液生成的生物量分別達到0.312 g、0.183 g、0.235 g，比對照組分別提高了9.1%、107.9%、39.9%;最適桑黃液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵時間11 d，pH值6.5。

桑黃;液體發(fā)酵;生物量;多糖;三萜;黃酮;優(yōu)化

桑黃(Inonotus sanghuang)又稱桑臣、桑耳，屬擔子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes)，銹革孔菌目(Hymenochaetales)，銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)，纖孔菌屬(Inonotus)［1－2］，有“森林黃金”之美稱，因其通常長在桑屬植物上，子實體呈黃褐色而得名［3］。有研究表明桑黃子實體的水提取物對小白鼠肉瘤S－180細胞的抑制率高達96.7%，具有獨特的抗腫瘤功效，是目前國際公認的生物抗癌領域中效果最顯著的一種珍稀藥用菌［4］;桑黃中的多糖是主要的抗腫瘤活性物質和免疫增強劑［5］，三萜和黃酮類成分也具有抗炎、抗菌、抗氧化等多種活性［6］。近年來，對桑黃的研究開發(fā)已逐漸成為國內外藥用真菌領域的研究熱點。

由于市場需求量大，自然形成的野生桑黃資源面臨枯竭，而目前桑黃的人工培育生物學效率又偏低，難以實現(xiàn)規(guī)模化栽培，極大地制約了桑黃產業(yè)的發(fā)展［7］。有研究表明，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)能在短時間內獲得大量細胞產物和代謝物，且操作簡化、控制性好，是滿足國內外市場需要的有效途徑［8］。為提高桑黃的生物量和活性物質含量，探索液體發(fā)酵生產的新途徑，本研究考察了桑枝水提物的添加對桑黃液體發(fā)酵的影響，并對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，現(xiàn)將試驗結果報告如下，供同仁參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 SH1501、SH1502、SH1503，均為湖南省蠶?？茖W研究所實驗室保存用種。

1.1.2 主要試劑及材料 葡萄糖、蒽酮、硫酸、熊果酸、香蘭素、冰醋酸、高氯酸、蘆丁、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等購自Sigma公司，均為分析純;土豆、蒸餾水等均為市售;桑枝為桑樹品種湘7920的夏伐枝條。

1.1.3 主要儀器設備 YXQ－LS－50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產品;PL203型電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司產品;DH G－9140型恒溫干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品;SW－CJ－2FO型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品;LRH－150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產品;KA－1000型臺式離心機，日本日立公司產品;U－1800型紫外可見分光光度儀，日本島津公司產品;ZHWY－2102C型恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司產品;其他為實驗室常規(guī)設備。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 (1)PDA斜面培養(yǎng)基的制備。將土豆200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L配制成PDA斜面培養(yǎng)基，自然pH值。(2)液體基礎培養(yǎng)基的制備。將葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蒸餾水1 L配制成液體基礎培養(yǎng)基，自然pH值。上述各培養(yǎng)基均于121℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌后備用。

1.2.2 母種活化與液體培養(yǎng) 按無菌操作要求取黃豆大小桑黃母種的菌種，轉接于PDA斜面培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)6 d，取邊緣的生長旺盛菌絲再接種于新斜面培養(yǎng)基上，反復轉接至菌絲恢復生長活力，保存?zhèn)溆谩?/p>

在裝液量100 mL的250 mL三角瓶中，按10 mg的接種量無菌接入活化后的桑黃母種菌絲，將三角瓶置于25℃恒溫培養(yǎng)室1 d，觀察液體培養(yǎng)基污染情況，再放入搖床在25℃、160 r/min振蕩條件下黑暗培養(yǎng)10 d，觀察菌絲及菌液的發(fā)酵情況，待用。

1.2.3 菌絲體生物量的測定 用布氏漏斗真空抽濾液體培養(yǎng)基得到菌絲體濾餅，收集上清液和菌絲沉淀，用蒸餾水反復沖洗、離心，直到清洗液不再帶有培養(yǎng)基的顏色為止。合并菌絲體，置于60℃的電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質量，冷卻后稱量。

1.2.4 活性物質含量的測定 (1)菌液中桑黃多糖的提取與檢測。以葡萄糖為標準品，繪制標準曲線回歸方程Y=5.141 8X+0.017 4，R2=0.997 1，測定桑黃多糖的含量［9］。(2)菌液中桑黃三萜的提取與檢測。以熊果酸為標準品，繪制標準曲線回歸方程Y=6.513 4X－0.020 2，R2=0.995 5，測定總桑黃三萜的含量［10］。(3)菌液中黃酮的提取與檢測。以蘆丁為標準品，繪制標準曲線回歸方程Y=11.811 6X+ 0.004 7，R2=0.999 2，測定總黃酮的含量［11］。

1.2.5 桑枝水提物的添加對不同桑黃菌株液體發(fā)酵的影響試驗 將桑枝烘干并粉碎，過10目篩，取500 g桑枝粉末加3 L蒸餾水煎煮30 min，過濾收集提取液，將濾渣重復提取1次，合并2次濾液，加入液體基礎培養(yǎng)基。以液體基礎培養(yǎng)基為對照，設置3個平行，經滅菌冷卻，按1.2.2項所述液體發(fā)酵的方法對3種桑黃菌株SH1501、SH1502、SH1503進行培養(yǎng)，10 d后分別測定生物量和各活性物質的含量。

1.2.6 最適液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素篩選 選用SH1501為供試菌株，接入液體基礎培養(yǎng)基中，按1.2.2所述液體發(fā)酵的方法培養(yǎng)，分別設置溫度梯度16、19、22、25、28℃，pH梯度6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，時間梯度3、5、7、9、11、13 d，單因素篩選，其他發(fā)酵條件不變，發(fā)酵成熟或到達設定時間后分別參照1.2.3和1.2.4項測定菌絲體生物量及發(fā)酵液中多糖、三萜和黃酮類物質的含量，確定最佳溫度、最佳初始pH、最佳液體發(fā)酵時間。

2 結果與分析

2.1 桑枝水提物對3種桑黃菌株液體發(fā)酵的影響

與常規(guī)液體培養(yǎng)基相比，桑枝水提液的添加對3種不同桑黃菌株生物量的積累效果明顯(圖1)，桑黃菌株SH1501、SH1502、SH1503每100 mL發(fā)酵液生成的生物量分別為0.312 g、0.183 g、0.235 g，比對照組分別提高了9.1%、107.9%、39.9%。而且，桑枝水提液對桑黃胞外活性產物的分泌也具有較好的誘導效果(圖2)，說明桑枝水提液中某些物質能被桑黃菌絲有效地吸收利用，除添加桑枝水提液的桑黃菌株SH1503的三萜含量稍低于對照外，其余各項指標與對照相比均有所增加;另外從圖中還能看出，桑黃菌株SH1502的三萜含量明顯高于其它菌株，添加桑枝水提液的三萜含量達到了2.765 mg/mL，對照值也達到了2.345 mg/mL，該結果應與種性特點相關。此外，由圖1－2還可以看出，每100 mL發(fā)酵液生成菌絲體的生物量與活性成分含量不具有相關性，如桑黃菌株 SH1502每100 mL發(fā)酵液生成的生物量在3個菌株中最低，而發(fā)酵液中三萜類和多糖類成分的含量卻相對較高。

圖1 桑枝水提液的添加對不同桑黃菌株生物量的影響

圖2 桑枝水提液的添加對不同桑黃菌株發(fā)酵液中活性成分含量的影響

2.2 最適液體發(fā)酵溫度的選擇

在一定溫度范圍內，桑黃菌株 SH1501每100 mL發(fā)酵液生成的菌絲體生物量隨著溫度的升高而快速增加，當發(fā)酵溫度為25℃時，生成的生物量達到峰值為0.088 g，之后隨著溫度的上升而下降(圖3)。從圖4可以看出，發(fā)酵溫度對桑黃多糖和黃酮含量的影響與每100 mL發(fā)酵液生成的生物量的變化趨勢相同，均在25℃時含量達到最高，分別為0.841 mg/mL和0.097 mg/mL，而發(fā)酵液中三萜類物質卻沒有因過高的溫度而導致含量有明顯下降的現(xiàn)象。綜合2個圖分析的結果，桑黃與多數藥用菌的生長特性吻合，即高溫環(huán)境有利于桑黃的正常生長，但溫度過高不僅會破壞菌絲的結構和活性，還會加速自身物質的消耗，導致生成的生物量與代謝產物的含量均降低。因此，25℃為最適液體發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對桑黃菌株SH1501生物量的影響

圖4 發(fā)酵溫度對桑黃菌株SH1501活性成分含量的影響

2.3 最適初始pH值的選擇

桑黃菌絲體產量受pH的影響較大，整個培養(yǎng)環(huán)境偏弱酸性時適合桑黃的生長發(fā)育(圖5)。當初始pH值為6.5時，桑黃菌株SH1501生長狀況良好，每100 mL發(fā)酵液生成的生物量達到最大值，為0.088 g，當pH值大于6.5時，菌絲體生成量隨pH值的增大而明顯減少。由圖6可知，桑黃發(fā)酵液中活性成分的分泌累積對pH值的耐受范圍較廣，各項指標在pH值6～8內沒有明顯差異，除三萜外，發(fā)酵液中多糖和黃酮的含量都在pH值為6.5時達到峰值，從最大限度獲得桑黃的生物量和活性物質含量的角度考慮，選擇培養(yǎng)基初始pH值為6.5。

圖5 初始pH值對桑黃菌株SH1501生物量的影響

圖6 初始pH值對桑黃菌株SH1501活性成分含量的影響

2.4 最適液體發(fā)酵時間的選擇

隨著發(fā)酵時間的延長，桑黃菌株 SH1501每100 mL發(fā)酵液生產的菌絲體生物量和活性成分含量不斷增加(圖7－8)，在11 d時達到最大值，生成的生物量0.088 g，發(fā)酵液中三萜含量2.345 mg/mL、多糖含量0.841 mg/mL、黃酮含量0.097 mg/mL。隨后各項指標值都有不同程度的下降，其原因可能是11 d后菌絲體大量聚集并伴有菌球自溶現(xiàn)象，菌絲老化，且培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質消耗殆盡，導致代謝產物含量逐漸降低。因此，綜合考慮，桑黃液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)時間為11 d。

圖7 發(fā)酵時間對桑黃菌株SH1501生物量的影響

圖8 發(fā)酵時間對桑黃菌株SH1501活性成分含量的影響

3 小結與討論

為提高桑黃的發(fā)酵生產效率，本試驗考察了桑枝水提物的添加對桑黃液體發(fā)酵的影響，并對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。研究結果表明，桑枝水提物能刺激桑黃菌絲的生長和活性代謝產物的分泌，其每100 mL發(fā)酵液生成的生物量以及發(fā)酵液中多糖類、三萜、黃酮類物質含量都明顯高于液體基礎培養(yǎng)基，本方法對桑黃菌絲的生長和藥理活性成分的積累具有明顯的促進作用，但桑枝水提物刺激桑黃菌絲生長和活性產物分泌的調節(jié)機理有待進一步研究。

采用單因素試驗對桑黃菌株SH1501進行液體培養(yǎng)，獲得最適的桑黃液體發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時間11 d、初始pH值6.5，該結論及變化趨勢與李瑞雪［12］等的研究結果相似。根據單因素的考察，今后將對影響桑黃液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行正交試驗和工藝驗證，為桑黃的擴大發(fā)酵生產提供一定的理論基礎和技術參考。為了進一步提高其生物學效率，今后需在桑黃生長的代謝途徑、誘導物篩選及兩者協(xié)同作用等方面繼續(xù)開展試驗研究。

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S886.9

A

1007－0982(2016)04－0017－04

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.004

2016－03－29;接受日期:2016－09－21

湖南省科技計劃重點研發(fā)項目(編號2015NK3054);現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專頂(編號CARS－22)。

第1作者信息:鄒湘月(1988—)，女，湖南長沙，碩士研究生，研究實習員。Tel:0731－84692978，E-mail:xiangyuezou@163.com

信息:顏新培，博士，研究員。E-mail:yanxinpei@sina.com