Ti?6Al?7Nb噴砂酸蝕處理后表面特性和生物相容性的實驗研究

孫鴻婉，李志剛，張靜瑩

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧錦州121000；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔科，遼寧大連116622）

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Ti?6Al?7Nb噴砂酸蝕處理后表面特性和生物相容性的實驗研究

孫鴻婉1，李志剛1，張靜瑩2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧錦州121000；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔科，遼寧大連116622）

摘要目的通過機械打磨、噴砂酸蝕2種不同方法分別處理純鈦（Ti）和Ti?6Al?7Nb（TC20）表面，在2種鈦片表面接種大鼠成骨細胞，探討鈦片表面的機械性能和大鼠成骨細胞的黏附、增殖情況。方法將實驗分為4組：Ti機械打磨組、Ti噴砂酸蝕組、TC20機械打磨組、TC20噴砂酸蝕組，在4組鈦片上接種大鼠成骨細胞，使用掃描電鏡和能譜分析儀分析4組鈦片表面形貌和元素含量，用3D激光共聚焦顯微鏡分析4組鈦片表面的粗糙度，電感耦合等離子發(fā)色光譜儀分析鈦片內(nèi)部元素析出量，倒置顯微鏡觀察大鼠成骨細胞形貌，MTT測量大鼠成骨細胞增殖情況。結(jié)果Ti和TC20機械打磨組表面呈機械劃痕，Ti和TC20噴砂酸蝕組表面擁有大量孔洞形貌；噴砂酸蝕處理的Ti和TC20表面有大量成骨細胞附著，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析成骨細胞在噴砂酸蝕組表面增殖能力強于機械打磨組，且Ti?6Al?7Nb處理組強于Ti噴砂酸蝕組（P< 0.05）。結(jié)論噴砂酸蝕處理的TC20表現(xiàn)出良好的機械性能和生物相容性，更能促進骨結(jié)合。

關(guān)鍵詞Ti；Ti?6Al?7Nb；噴砂酸蝕；成骨細胞

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Experimental Study on the Ti?6Al?7Nb Surface Properties and Biological Compatibility by Sandblast and Acid?etching

SUNHong?wan1，LIZhi?gang1，ZHANGJing?ying2

（1.Stomatological Department，The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.Stomatological Department，Medical College of Dalian University，Dalian116622，China）

Abstract Objective To process pure titanium（Ti）and Ti?6Al?7Nb（TC20）surface by mechanical grinding and sandblast and acid?etching（SLA），discussthemechanicalpropertiesofthetitaniumsurface，andevaluatetheadhesionandproliferationofratosteoblastsonthetwokindsofti?tanium surface.Methods The experiment was divided into 4 groups：Ti mechanical grinding group，Ti SLA group，TC20 mechanical grinding group，and TC20sLA group.Then osteoblasts were seeded onto the titanium plate of different groups.Titanium surface morphology and elemental compositionwereanalyzedby SEMand EDX.Surfaceroughnessoftitaniumplatewasanalyze3Dlaserconfocalmicroscopy.Theinternalelementsof titanium and titanium alloy precipitation were measured by inductively coupled plasma spectrometer.Adhesion of osteoblast cells on different titani?um surface were observed by scanning electron microscope，and the proliferation of osteoblast was analyzed by MTT test.Results Scratches were observed on Ti and TC20surface in mechanical grinding group，a large hole morphology was found in SLA groups.There were a lot of rat osteoblasts adhered to the titanium surface with SLA processing，and the proliferative ability of osteoblasts in sandblast and acid?etching SLA groups was stron?ger than mechanical grinding groups through the statistical analysis（P< 0.05）.Conclusion TC20 with SLA processing showed better mechanical propertiesandbiocompatibility，whichcansignificantlypromoteboneunion.

Keywords titanium；Ti?6Al?7Nb；sandblastandacid?etching；osteoblast

種植牙技術(shù)是目前修復(fù)牙列缺損的重要手段，種植體表面改性處理已成為近年口腔領(lǐng)域研究的熱點，種植體表面改性處理越好越有利于骨結(jié)合，骨結(jié)合能力越好，種植體的成活率也就越高。鈦種植體可以通過以下幾種方法改變其表面性能。物理處理法：表面涂層法、離子注入法等；化學(xué)處理法：酸蝕法、堿熱處理法、陽極氧化法、微弧氧化法、溶膠－凝膠法等［1］。表面涂層技術(shù)在純鈦（Ti）及鈦合金表面形成多孔結(jié)構(gòu)，能夠促進種植體與骨組織的早期骨愈合，但是涂層和金屬基體之間因界面結(jié)合力不強而容易造成涂層剝脫的問題［2］，而且表面涂層技術(shù)也不適合在形狀復(fù)雜的種植體表面制備均勻的涂層。

噴砂酸蝕是種植體制作常用的一種方法。噴砂酸蝕是一種非涂層表面處理方法，它是將鈦片進行噴砂處理后再進行酸蝕，從而在鈦片表面形成大窩洞套小窩洞的二級孔洞形態(tài)。目前在生物醫(yī)療領(lǐng)域Ti是使用最多的金屬材料，占了Ti及鈦合金材料市場的50%份額［3］。但是Ti強度低，不耐磨，氧化后表面呈灰色影響美觀［4］，而Ti?6Al?7Nb（TC20）的彈性模量更接近人體組織。因此本研究通過噴砂酸蝕技術(shù)處理種植體表面，通過與Ti對比，探索TC20種植體材料的機械性能和生物相容性。

1　材料與方法

1.1設(shè)備與儀器

噴砂設(shè)備（JY?80D吸入式干燥砂機，北京九野機械制造有限公司）；噴砂介質(zhì)（Al2O3、SiO2、Fe2O3）；3D測量激光共聚焦顯微鏡（2M01464，日本Olympus公司）；SEM超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡（NOVA NanoSEM450，美國FEI公司）；ICP電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（Optima 2000DV，上海鑄金分析儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（XSP?63XDV，上海光學(xué)儀器一廠）；能譜分析儀（浙江容大川檢測有限公司）。

1.2樣品制備

制備出直徑14 mm、厚1 mm的Ti和TC20兩種鈦片，將所有鈦片放在裝有丙酮的無水乙醇中超聲清洗30 min，再在800目、1 500目、2 000目的砂紙上進行機械打磨，將鈦片表面的氧化層和污垢層清理干凈，放入100%丙酮和100%乙醇中超聲清洗30 min，干燥儲存。將Ti和TC20各取一半在0.2 MPa壓強下噴砂30s，放入裝有丙酮的乙醇中超聲清洗30 min，用蒸餾水、濃硫酸、濃鹽酸按11∶12∶2體積比配置酸蝕液，Ti、TC20分別酸蝕80s，之后放入無水乙醇中超聲震蕩30 min后取出干燥。樣品分為4組：Ti機械打磨組、Ti噴砂酸蝕組、TC20機械打磨組、TC20噴砂酸蝕組。

1.3表面特性分析

用掃描電鏡分析Ti和TC20機械打磨組和噴砂酸蝕組表面形貌，能譜分析測量樣品表面元素含量，3D激光共聚焦顯微鏡測量樣品表面的粗糙度和三維立體結(jié)構(gòu)。

1.4樣品內(nèi)部元素析出量

模擬體液由NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、CaCl、Na2SO4配置，用HCl和Tris將溶液pH調(diào)節(jié)到7.40。將4組樣品分別放入30 mL、37℃模擬體液中浸泡7、14、21和28 d后各取3 mL，用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀進行分析。

1.5大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)

取出SD大鼠頭蓋骨，用PBS沖洗頭蓋骨，將血液沖洗干凈，培養(yǎng)皿中加PBS，刮除骨膜和結(jié)締組織，用手術(shù)剪刀將頭蓋骨剪碎，移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液。加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫消化20 min，吸出消化液，加入完全培養(yǎng)基，吹打骨片，將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

1.6大鼠成骨細胞形態(tài)觀察

在24孔細胞培養(yǎng)板中分別放入4組鈦片，將接種于鈦片表面的細胞用0.25%的胰酶消化下來進行細胞計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/mL，吹打均勻后輕緩接種到每個樣品表面，每個樣品上接種細胞密度為1× 104/mL，4 h后每孔添加1 mL完全培養(yǎng)基，48 h后2.5%戊二醛置于4℃固定，4 h后棄戊二醛用50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水，每個梯度進行2次，每次30 min，過夜完全干燥，送檢前噴金，于掃描電鏡下觀察細胞的伸展情況。

1.7大鼠成骨細胞MTT測定

將消化下來的細胞調(diào)整濃度至1×105/mL，將細胞懸液輕緩地接種到4組樣品表面，每個鈦片表面接種細胞密度為1×104/mL，每個樣本設(shè)3個平行孔。4 h后每孔補加1 mL完全培養(yǎng)基，37℃下孵育1、3、5 d。于相應(yīng)時間點上棄去原培養(yǎng)基后，每個鈦片表面加550 μL MTT（50 μL，5 μg/mL MTT加500 μL無血清培養(yǎng)基），37℃、5%CO2濃度條件下孵育4 h，去除無血清培養(yǎng)基，每孔加400 μL二甲基亞砜，移液槍吹打均勻后將溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，24孔板中的每個孔能轉(zhuǎn)移至96孔板中的3個孔，每組3個平行孔，能轉(zhuǎn)移96孔板中的9個孔，最后于酶標儀下測定570 nm下的吸光光度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1樣品表面機械性能

如圖1所示，Ti和TC20機械打磨組樣品表面為光滑平面，無污垢和氧化層；Ti和TC20噴砂酸蝕組樣品表面呈多孔結(jié)構(gòu)，具有微米級和納米級的孔洞形態(tài)，邊緣銳利。Ti和TC20經(jīng)能譜分析儀檢測，可知前者只含有Ti元素，TC20由Ti、Al、Nb元素組成。樣品表面粗糙度如圖2所示，機械打磨組Ti和TC20表面比較光滑，有一些較淺的劃痕，無孔洞結(jié)構(gòu)，而噴砂酸蝕組樣品表面有高低起伏的彈坑狀結(jié)構(gòu)，從三維立體結(jié)構(gòu)更能清晰的看見大孔中套有小孔，邊緣銳利。

A，Ti mechanical grinding group；B，Ti sandblast and acid?etching group；C，TC20 mechanical grinding group；D，TC20sandblast and acid?etching group.圖1　樣品機械打磨和噴砂酸蝕處理后鈦片表面形貌Fig.1 Sample surface topography after mechanical grinding and sandblast and acid?etching

A，Ti mechanical grinding group；B，Ti sandblast and acid?etching group；C，TC20 mechanical grinding group；D，TC20sandblast and acid?etching group.圖2　機械打磨和噴砂酸蝕后樣品表面粗糙度Fig.2 Sample surface roughness after mechanical grinding and sandblasting acid corrosion

2.2樣品內(nèi)部元素析出

將Ti和TC20浸入到模擬體液中，放入37℃恒溫搖床上，7、14、21和28 d后樣品內(nèi)部元素析出量（圖3）。Ti樣品隨著天數(shù)的增加Ti元素逐漸增多，到28 d后析出量為0.015 3 mg/L，之后析出量趨于穩(wěn)定；TC20樣品隨著天數(shù)的增加Nb元素?zé)o析出，Ti元素逐漸增多，28 d后達0.015 6 mg/L，趨于穩(wěn)定，Al元素在14 d析出量達到高峰，之后呈下降趨勢。

圖3　樣品進入模擬體液7、14、21和28 d后內(nèi)部元素析出量Fig.3 The precipitation amount of sample internal elements after the samples soaked into simulated body fluid for 7，14，21，and 28 d

2.3大鼠成骨細胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察到大鼠成骨細胞為長短不一的細長的紡錘型和梭形等，細胞核明顯，核仁清晰可見（圖4）。

圖4　倒置顯微鏡下大鼠成骨細胞結(jié)構(gòu)×100Fig.4　Structure of rat osteoblasts under inverted microscope ×100

2.4大鼠成骨細胞黏附情況

由圖5可知，大鼠成骨細胞均能黏附于4組樣品上，在Ti和TC20機械打磨組樣品上成骨細胞只有輕微的附著，在Ti和TC20噴砂酸蝕組可以發(fā)現(xiàn)成骨細胞的偽足深入到孔洞中，成骨細胞牢固附著于鈦片表面，其中TC20噴砂酸蝕組成骨細胞黏附形態(tài)好于Ti噴砂酸蝕組。

2.5大鼠成骨細胞增殖情況

由圖6可知，成骨細胞接種于樣品表面1、3、5 d后，隨著時間的增長樣品表面的細胞逐漸增多，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，Ti噴砂酸蝕組細胞增長量多于Ti機械打磨組，TC20噴砂酸蝕組細胞增長量多于TC20機械打磨組，且TC20噴砂酸蝕組又好于Ti噴砂酸蝕組（均P< 0.05）。

3　討論

種植體表面孔洞的大小一直以來被認為是表面機械性能好壞的最重要因素之一。目前研究種植體—骨結(jié)合主要是通過種植體表面改性處理。魏艷萍等［5，6］通過實驗證實噴砂酸蝕處理鈦片表面比光滑表面更能促進成骨細胞增殖及功能活性表達。噴砂酸蝕形成的一級孔洞為細胞提供附著點，引導(dǎo)細胞黏附、伸展和分化；二級微、納米級孔洞為細胞提供點狀接觸，刺激細胞反應(yīng)，兩者作用疊加則增加黏著斑水平從而促進骨源性環(huán)境形成［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，樣品表面的粗糙度和表面形貌在生物材料的生物相容方面起了重要作用［8］。有實驗采用β型鈦合金TC20，相較于第一代鈦合金不含有礬等毒性元素，力學(xué)性能好，適合用作體內(nèi)植入材料［9］。

有研究采用大鼠成骨細胞做細胞毒性試驗，發(fā)現(xiàn)成骨細胞在骨形成、發(fā)育、改建和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。細胞黏附在鈦片表面分為以下過程：血清蛋白吸附于鈦片基底；細胞與鈦片基底相連；細胞向鈦片中延伸。研究表明［10］，多孔結(jié)構(gòu)增加了鈦片表面積從而增加了細胞的附著。鈦片表面粗糙度的增加有利于刺激成骨細胞的黏附、增殖［11，12］。鈦片的微孔結(jié)構(gòu)能夠影響細胞的增殖、分化、黏附及生長，有利于進一步的誘導(dǎo)成骨［13，14］。

噴砂酸蝕技術(shù)在Ti和TC20表面形成了多孔結(jié)構(gòu)，提高了樣品表面的粗糙度，有利于大鼠成骨細胞的黏附和增殖，其中TC20的各種性能又優(yōu)于Ti，因此TC20鈦合金應(yīng)用于種植體能夠更大程度提高骨整合。

A，Ti mechanical grinding group；B，Ti sandblast and acid?etching group；C，TC20 mechanical grinding group；D，TC20sandblast and acid?etching group.圖5　大鼠成骨細胞在4組鈦片上的黏附形態(tài)Fig.5 Adhesion morphology of rat osteoblasts on the materials of 4 groups

圖6　4組中成骨細胞增殖Fig.6 Osteoblast proliferation in 4 groups

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（編輯陳姜）

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收稿日期：2015-07-16

通信作者：李志剛，E-mail：ZGLi700103@163.com

作者簡介：孫鴻婉（1990-），女，碩士研究生.

基金項目：國家自然科學(xué)基金（51371042）；中國博士后自然科學(xué)基金（2014M551097）；大連市科技計劃（2013E11SF057）；遼寧省博士科研啟動基金（20141198）

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.003

中圖分類號R783.1

文獻標志碼B

文章編號0258-4646（2016）01-0012-06