隨機(jī)轉(zhuǎn)座子插入構(gòu)建甲型副傷寒桿菌啟動(dòng)子文庫

許澤仰，洪愉，馮夢蝶，毛普加，趙繼華，楊洪文，宋武戰(zhàn)，王紀(jì)愛，黃芬，井申榮，曾韋錕

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；2.昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，昆明650214；3.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明650032）

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隨機(jī)轉(zhuǎn)座子插入構(gòu)建甲型副傷寒桿菌啟動(dòng)子文庫

許澤仰1，2，洪愉3，馮夢蝶1，毛普加1，趙繼華3，楊洪文3，宋武戰(zhàn)3，王紀(jì)愛2，黃芬1，井申榮1，曾韋錕1，2

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；2.昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，昆明650214；3.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明650032）

摘要目的構(gòu)建攜帶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）的轉(zhuǎn)座子自殺性質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)座獲得甲型副傷寒沙門氏菌（副甲）啟動(dòng)子文庫。方法PCR擴(kuò)增CAT的基因亞克隆至pMD?18T載體，鑒定正確后酶切插入轉(zhuǎn)座子自殺性質(zhì)粒pSC189，獲得新的轉(zhuǎn)座子載體pSC?CAT，將攜帶pSC?CAT的供體菌與副甲受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)座，涂布氯霉素平板篩選轉(zhuǎn)座的細(xì)菌，以隨機(jī)篩選出來的細(xì)菌基因組為模板，熱不對稱PCR擴(kuò)增插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，并進(jìn)行測序、比對分析。結(jié)果篩選獲得約1 000個(gè)突變菌，隨機(jī)挑取6個(gè)菌，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的上游分別對應(yīng)6個(gè)可疑啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)論通過自殺性轉(zhuǎn)座子載體pSC?CAT可高效獲得副甲菌啟動(dòng)子文庫，為進(jìn)一步研究副甲菌基因表達(dá)與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞甲型副傷寒沙門氏菌；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶；pSC189；接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座

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Constructionofa Promoter Libraryof SalmonellaparatyphiAby Inserting Transposon

XU Ze?yang1，2，HONG Yu3，F(xiàn)ENG Meng?die1，MAO Pu?jia1，ZHAO Ji?hua3，YANG Hong?wen3，SONG Wu?zhan3，WANG Ji?ai2，HUANGFen1，JINGShen?rong1，ZENGWei?kun1，2
（1.Medical Faculty，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Department of Clinical Laboratory，Medical Faculty，Kunming Uni?versity，Kunming650214，China；3.Departmentof Nuclear Medicine，Kunming General Hospitalof Chengdu Military Command，Kunming650032，China）

Abstract Objective To establish a promoter library of SalmonellaparatyphiA by transposition with new suicide plasmid with transposon，which containingchloramphenicolacetyltransferase（CAT）asthereportgene.Methods The CATgeneofwasamplifedby PCRandclonedintopMD18?T vector.The above fragment was then inserted to suicide plasmid pSC189，and the new plasmid was named pSC?CAT.After conjugation between S17?1λpir/pSC?CAT and SalmonellaparatyphiA，the mixer was put on the plate containing chloramphenicol to screen the transductants.The ge?nome of random picked bacteria was extracted as template of the thermal asymmetric interlaced PCR（Tail?PCR）to amplify flanking sequence near insertion site.The PCR products were sequenced and analysed with blast.Results About 1000mutant strains were got.Six suspicious promoter re?gions were found in the front of inserted site from six random selected bacteria.Conclusion A promoter library of Salmonella paratyphi A could be effectively established through suicide vector pSC?CAT，which laid a foundation for further study of gene expression and regulation of Salmonella paratyphiA.

Keywords Salmonella paratyphi A；chloramphenicol acetyltransferase；pSC189；conjugate transpose

甲型副傷寒沙門氏菌引起的腸熱病，在發(fā)達(dá)和發(fā)展中國家都并不罕見，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題［1］。副傷寒可引起高燒、腹痛等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［2，3］。在全球范圍內(nèi)每年大約有2 100萬人患病，其中約70萬人死亡，主要發(fā)生在東南亞、非洲和拉丁美洲等地［4］。目前對于甲型副傷寒沙門氏菌研究相對較少，深入研究該菌的生物學(xué)特性和致病機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

啟動(dòng)子是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的必要調(diào)控原件，決定了基因表達(dá)的強(qiáng)度和時(shí)機(jī)，通過影響啟動(dòng)子可以改變細(xì)胞基因的表達(dá)［5］，研究致病菌的各種生命活動(dòng)及代謝調(diào)控，能夠控制致病菌的感染及傳播。

篩選啟動(dòng)子的方法通常是用啟動(dòng)子陷阱載體，比如作者前期構(gòu)建的甲型副傷寒沙門氏菌啟動(dòng)子文庫［6］。該方法需要提取基因組，酶切后插入啟動(dòng)子陷阱載體，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，如報(bào)告子選用非抗性基因，背景較雜，篩選工作量大。為了獲得方便、簡單的啟動(dòng)子文庫菌，本研究以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）為報(bào)告基因插入轉(zhuǎn)座子自殺性載體pSC189，探索通過接合轉(zhuǎn)座及氯霉素篩選高效、便捷獲得啟動(dòng)子文庫菌的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑：限制性內(nèi)切酶BssHⅡ、NdeⅠ、NcoⅠ、T4 DNA連接酶、DNAMaker DL 2000、DL 5000、pMD18?T購自寶生物工程（大連）有限公司，Pfu酶、dNTP購自天根生化科技（北京）有限公司，F(xiàn)astAP、蛋白酶K購自Fermentas公司，CTAB購自Sigma公司，RNase、利福平、卡那霉素（Kan）、氯霉素、氨芐青霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA小量瓊脂糖回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，酵母粉、蛋白胨購自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司，引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成［7，8］，見表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2菌株及質(zhì)粒：菌株，S17?1λpir、E.coli DH5a、利福平抗性甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50973（副甲Rif+）［9］；質(zhì)粒，pSC189［9］、pACYC184（圖1）；副甲CMCC50973特異性噬菌體LSPA1［10］均為昆明理工大學(xué)基因工程與制藥實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3培養(yǎng)基及緩沖液：LB培養(yǎng)液：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化鈉，蒸餾水1 000 mL（固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂），121℃滅菌20 min。

1.2方法

圖1　質(zhì)粒pACYC184與pSC189Fig.1 pACYC184 plasmid and pSC189 plasmid

1.2.1載體pSC?CAT的構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物（表1），以pACYC184為模板，PCR擴(kuò)增CAT的基因片段，上、下游分別引入BssHⅡ酶切位點(diǎn)。將上述基因亞克隆至pMD18?T載體，將酶切鑒定正確的載體命名為pT?CAT，酶切及測序鑒定正確后用BssHⅡ酶切pT?CAT，回收小片段插入經(jīng)相同酶切并去磷酸化的pSC189載體，轉(zhuǎn)化S17?1λpir，提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后命名為pSC?CAT，重組菌命名為S17?1λpir/pSC?CAT。

1.2.2接合轉(zhuǎn)座：分別取1 mL過夜培養(yǎng)的S17?1λ pir/pSC?CAT與副甲Rif+，12 000 r/min離心1 min，棄上清沉淀用1 mL滅菌生理鹽水重懸，12 000 r/min離心1 min，棄上清用500 μL滅菌生理鹽水重懸。取50 μL上述副甲與100 μL S17?1λpir/pSC?CAT混合均勻后，涂至無菌0.2 μm濾膜上，正面朝上貼于無抗固體LB平板，37℃培養(yǎng)3 h。無菌條件下，用鑷子取出濾膜，1 mL生理鹽水洗下膜上菌苔，混勻即為洗膜液。

1.2.3副甲特異性噬菌體LSPA1驗(yàn)證突變菌：取50 μL菌液涂在三抗平板上（利福平200 μg/mL、Kan 50 μg/mL、氯霉素10 μg/mL），37℃培養(yǎng)36 h后隨機(jī)挑出6個(gè)菌落接菌到5 mL的LB培養(yǎng)基中，搖瓶增菌，然后在三抗平板上劃線（利福平200 μg/mL、Kan 50 μg/mL、氯霉素10 μg/mL），待干燥后于線上滴加1滴噬菌體LSPA1原液（用滅菌的半透膜過濾，病毒滴度約為2×1010pfu），37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4熱不對稱PCR鑒定：基因組提取，分別取過夜培養(yǎng)的6株陽性菌5 mL，12 000 r/min離心1 min，沉淀用567 μL的TE重懸，加入30 μL的10%SDS、3 μL蛋白酶K，37℃溫育1 h；加入100 μL 5 mol/L Na?Cl，充分混勻，再加80 μL CTAB/NaCl，混勻，65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇混勻，12 000 r/min離心5 min，收集上清；再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，12 000 r/min離心5 min，收集上清；加入0.6倍體積的異丙醇，旋轉(zhuǎn)混勻有白色沉淀，12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%和無水乙醇各洗1次、晾干，沉淀用100 μL TE重懸。將6株陽性菌的基因組進(jìn)行3輪不對稱PCR［11］。第一輪用非特異性上游引物CEKG2A，下游引物是轉(zhuǎn)座子的特異性引物IR2；第二輪PCR時(shí)，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍作為模板，用引物Mar3、CEKG4擴(kuò)增；第三輪PCR時(shí)，將第二輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍作為模板，用引物IR2?60?5、CEKG4擴(kuò)增。將擴(kuò)增出來的條帶切膠回收，用IR2?60?5引物測序（上海生工）。擴(kuò)增條件見表2。

表2　熱不對稱PCR擴(kuò)增條件Tab.2 The conditions of Tail?PCR

1.2.5NCBI比對：將測序結(jié)果提交NCBI與副甲標(biāo)準(zhǔn)株ATCC9150（GI：NC_006511）進(jìn)行比對分析，獲得插入位點(diǎn)所在的基因信息。

2　結(jié)果

2.1pT?CAT酶切鑒定結(jié)果及測序結(jié)果

pT?CAT用BssHⅡ酶切鑒定，結(jié)果見圖2，能夠切出849 bp的目的條帶，證明載體構(gòu)建成功。

2.2pSC?CAT的構(gòu)建及鑒定

pSC?CAT分別用NdeⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，結(jié)果見圖3，若為正向單克隆插入，則NdeⅠ酶切后小片段為1 810 bp，NcoⅠ酶切后小片段為2 051 bp，從圖中明顯看出2個(gè)酶切條帶的大小與預(yù)期相符，證明了構(gòu)建成功并且是正向的。

1，pT?CAT plasmid；2，digestion products of pT?CAT by BssHⅡ；M，DL2000 marker.圖2　重組質(zhì)粒pT?CAT的酶切鑒定Fig.2 Digestion identification of recombinant pT?CAT

1，pSC?CAT plasmid；2，digestion products of pSC?CAT by NdeⅠ；3，di?gestion products of pSC?CAT by NcoⅠ；M，DL5000 marker.圖3　重組質(zhì)粒pSC?CAT的酶切鑒定Fig.3 Digestinon identification of recombinant pSC?CAT

2.3副甲特異性噬菌體LSPA1驗(yàn)證突變菌

將隨機(jī)挑選出來的6株突變菌在三抗平板劃線，在線上滴加噬菌體原液，37℃培養(yǎng)過夜；6株陽性菌滴加噬菌體處無細(xì)菌生長，說明6株陽性菌都是副甲菌（圖4）。

圖4　6株突變菌的噬菌體鑒定Fig.4 Identification of six mutational strains by phage

2.4熱不對稱PCR法鑒定轉(zhuǎn)座子插入宿主的相關(guān)基因

熱不對稱PCR第三輪結(jié)果見圖5，經(jīng)過3輪PCR 后1號到4號樣品獲得明顯單一的條帶，5號與6號較為彌散，但和理論上基本一致。證明6株突變菌是轉(zhuǎn)座成功的，并篩選出了相關(guān)啟動(dòng)子的位置。

圖5　6株突變菌的熱不對稱PCRFig.5 The tail?PCR of six mutational strains

2.5NCBI法分析比對轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因

將測序結(jié)果與副甲標(biāo)準(zhǔn)株ATCC9150（GI：NC_ 006511）進(jìn)行對比，插入位點(diǎn)信息見表3，插入的位點(diǎn)基因分別編碼膜內(nèi)在蛋白，假設(shè)的三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，假設(shè)的保守蛋白質(zhì)，HlyD?family分泌蛋白，假設(shè)的保守蛋白，假設(shè)的膜蛋白，說明副甲菌編碼的6種蛋白鄰近位置是含有啟動(dòng)子的。

3　討論

啟動(dòng)子位于編碼基因上游，可被RNA聚合酶識別、結(jié)合，是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件之一，具有“開關(guān)”基因的作用。通過啟動(dòng)子的插入或者缺失能夠有效地調(diào)控細(xì)菌的代謝，抑制致病菌的核心蛋白的表達(dá)，降低其感染效率或毒性，從而控制致病菌或病毒的感染及傳播［12］。

表3　插入位點(diǎn)基因列表Tab.3 List of the genes identified at the insertion site

常用的酶切插入啟動(dòng)子陷阱載體篩選啟動(dòng)子的方法過程復(fù)雜、操作要求高，存在背景較雜，篩選工作量大的缺點(diǎn)，因此本文嘗試構(gòu)建攜帶無啟動(dòng)子抗性基因的轉(zhuǎn)座載體，利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入副甲染色體的方法篩選啟動(dòng)子。

研究中所用的pSC189含“睡美人”轉(zhuǎn)座子以及“睡美人”C9轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒，復(fù)制子ori R6K具有π蛋白依賴性，只在表達(dá)π蛋白菌株中復(fù)制，對無π蛋白細(xì)菌表現(xiàn)為自殺特性。其攜帶有的轉(zhuǎn)座片段可隨機(jī)插入細(xì)菌基因組［13］。CAT是常用的原核抗性蛋白，可使氯霉素乙酰化而失去活性，野生副甲對其敏感，因此本研究將CAT的基因克隆插入轉(zhuǎn)座片段中作為啟動(dòng)子篩選標(biāo)記。其轉(zhuǎn)座后如果插入位置前有適合的啟動(dòng)子，則能夠表達(dá)氯霉素的抗性，由于供體菌（S17?1λpir）無利福平抗性，因此通過同時(shí)添加了利福平、卡那、氯霉素抗性平板可篩選出含有啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座突變菌。在篩選時(shí)，篩選的非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如果施加其他額外因素，如不同pH、鹽、溫度等，可獲得誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，同時(shí)可以通過測定轉(zhuǎn)座突變細(xì)菌表達(dá)的CAT酶的活性，對啟動(dòng)子的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入受體菌的辦法包括電轉(zhuǎn)和接合轉(zhuǎn)座的方法，前者轉(zhuǎn)化效率低，而后者轉(zhuǎn)化效率高且操作簡單方便。在本實(shí)驗(yàn)中采用pSC?CAT轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的供體菌（S17?1λpir）通過接合轉(zhuǎn)座副甲菌，該操作方法簡單易行，同時(shí)具有很高的效率，重復(fù)操作即可獲得大量轉(zhuǎn)座插入菌。

轉(zhuǎn)座子插入后，如何獲得插入位置基因是分析的關(guān)鍵。熱不對稱PCR可用于分析已知序列一側(cè)的未知序列，利用轉(zhuǎn)座子1段特異性引物和1條非特異性引物，隨機(jī)擴(kuò)增出含目的片段一端和突變位點(diǎn)一端的條帶，通過測序就可以分析插入位點(diǎn)信息。熱不對稱PCR通常經(jīng)過多輪PCR完成，本文中初始實(shí)驗(yàn)選用了3條非特異性引物（CEKG2A、CEKG2B、CEKG2C），結(jié)果通過3輪擴(kuò)增，其中CEKG2A擴(kuò)增效果較好，因此選擇CEKG2A擴(kuò)增出來的第三輪產(chǎn)物進(jìn)行測序。從測序結(jié)果看，獲得的基因序列中均含有轉(zhuǎn)座子1段的序列，說明該片段的確實(shí)來源于轉(zhuǎn)座子插入，同時(shí)其余片段提交NCBI與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC9150比對，DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)菌株部分基因序列高度同源，進(jìn)一步分析，轉(zhuǎn)座子插入鄰近位置均含有某些基因ORF的5’端非編碼區(qū)域，也就是啟動(dòng)子系列的理論存在位置，說明獲得的結(jié)果是可信的。

通過本研究獲得的副甲轉(zhuǎn)座子文庫菌，為進(jìn)一步研究副甲生物學(xué)特性以及致病機(jī)理奠定了良好基礎(chǔ)。同時(shí)pSC?CAT載體作為一種通用工具，同樣也可用于其他革蘭陰性細(xì)菌，因而具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯于溪）

·論著·

收稿日期：2015-01-25

通信作者：曾韋錕，E-mail：zengweikun@126.com

作者簡介：許澤仰（1990-），男，碩士研究生.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31160193）；云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2015Z168）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2010ZC055；2012FB135）

Doi：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.01.002

中圖分類號R378.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號0258-4646（2016）01-0007-05