腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的病理學(xué)機(jī)制研究△

黃繼義　林　鷹　逯富華　朱茂述（廈門(mén)市第五醫(yī)院腎內(nèi)科　廈門(mén)361000）

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腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的病理學(xué)機(jī)制研究△

黃繼義林鷹逯富華朱茂述（廈門(mén)市第五醫(yī)院腎內(nèi)科廈門(mén)361000）

摘要：目的：研究腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的病理學(xué)機(jī)制。方法：80只雄性大鼠隨機(jī)平分為假手術(shù)組和UUO模型組，每組40只，行大鼠左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組游離左側(cè)輸尿管但不予結(jié)扎，其余手術(shù)與UUO模型組相同。分別于術(shù)后d3、d7、d10、d14、d21每組處死8只，取大鼠左側(cè)腎臟。①檢測(cè)并比較假手術(shù)組和UUO模型組大鼠線(xiàn)粒體相關(guān)基因的表達(dá)水平；②檢測(cè)兩組大鼠腎臟組織COX和SOD含量變化；③檢測(cè)兩組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)變化；④檢測(cè)并比較腎體比、腎功能和腎組織Hyp含量動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：與假手術(shù)組大鼠相比，①UUO模型組大鼠的線(xiàn)粒體相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），包括線(xiàn)粒體mtDNA、再生基因（PGC1a、NRF1和Tfam）、斷裂基因（Mfn1、Mfn2和Opa1）和融合基因（Drp1和Fis1）；②UUO模型組大鼠在造模后10d、14d和21d，腎臟組織中的COX水平顯著升高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05），造模時(shí)間越長(zhǎng)，UUO模型組大鼠COX水平越高（P＜0.05），SOD水平越低；③UUO模型組大鼠造模后10d、14d和21d，腎臟組織RIF指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；④UUO模型組大鼠腎體比明顯升高且一直維持在較高水平（P＜0.05），造模時(shí)間越長(zhǎng)，模型大鼠血清Scr和BUN水平及腎組織Hyp含量水平逐漸升高，與假手術(shù)組相比均具有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：與假手術(shù)組大鼠相比，UUO模型組大鼠腎組織中的線(xiàn)粒體更活躍，線(xiàn)粒體基因、再生基因、斷裂基因和融合基因含量升高，COX含量升高，SOD含量降低，RIF指數(shù)升高，腎體比、血清Scr和BUN和腎組織Hyp水平顯著升高。

關(guān)鍵詞：腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷腎間質(zhì)纖維化病理學(xué)機(jī)制

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性腎臟疾病的共同特征，典型特征包括：小管基底膜成分及間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix ECM）發(fā)生定性和定量改變、腎小管發(fā)生萎縮、肌纖維母細(xì)胞的積聚。國(guó)內(nèi)外大量研究已發(fā)現(xiàn)在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中，腎小管基膜被破壞的同時(shí)常常伴有腎小管上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，此種現(xiàn)象被稱(chēng)為上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（epithelialmesenchymal transformation, EMT），繼之出現(xiàn)間質(zhì)區(qū)ECM大量產(chǎn)生和沉積，導(dǎo)致間質(zhì)區(qū)擴(kuò)展加寬，腎小管萎縮,形成間質(zhì)纖維化病損[1，2]。從腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷介導(dǎo)細(xì)胞死亡探討腎小管解離參與RIF進(jìn)展的重要機(jī)制，國(guó)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道、國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。

1　研究對(duì)象與研究方法

1.1研究對(duì)象：購(gòu)買(mǎi)SD雄性大鼠，隨機(jī)分為UUO模型組（n=40）和假手術(shù)組（n=40），行大鼠左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組游離左側(cè)輸尿管但不予結(jié)扎，其余手術(shù)與UUO模型組相同。分別于術(shù)后d3、d7、d10、d14、d21每組處死8只，取大鼠左側(cè)腎臟。

1.2研究方法

1.2.1Real-time PCR檢測(cè)假手術(shù)組和UUO模型組大鼠線(xiàn)粒體相關(guān)基因的表達(dá)水平比：采用Real-time PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體mtDNA、再生基因（PGC1a、NRF1和Tfam）、斷裂基因（Mfn1、Mfn2和Opa1）與融合基因（Drp1和Fis1）的表達(dá)水平。

1.2.2假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織COX和SOD含量比較：采用Real-time PCR檢測(cè)COX和SOD含量。

1.2.3假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)比較：大鼠腎臟組織Masson染色后可見(jiàn)：RTEC胞漿、腎間質(zhì)細(xì)胞漿、肌成纖維細(xì)胞與紅細(xì)胞染為紅色，細(xì)胞核染色呈現(xiàn)藍(lán)色，膠原纖維染為綠色為陽(yáng)性。計(jì)數(shù)染色為綠色的數(shù)量。

1.2.4假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎體比、腎功能和腎組織Hyp含量動(dòng)態(tài)變化比較

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料以均值±SEM表示，多組間比較運(yùn)用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson分析，數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1假手術(shù)組和UUO模型組大鼠線(xiàn)粒體相關(guān)基因表達(dá)水平比較：與假手術(shù)組大鼠相比，UUO模型組大鼠的線(xiàn)粒體相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），包括線(xiàn)粒體mtDNA、再生基因（PGC1a、NRF1和Tfam）、斷裂基因（Mfn1、Mfn2和Opa1）和融合基因（Drp1和Fis1）。此研究結(jié)果UUO模型組大鼠腎臟組織中線(xiàn)粒體活性顯著增強(qiáng)，見(jiàn)表1。

表1　假手術(shù)組和UUO模型組大鼠線(xiàn)粒體相關(guān)基因表達(dá)水平比較

2.2假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織COX和SOD含量比較：與假手術(shù)組大鼠相比，UUO模型組大鼠在造模后10d、14d 和21d，腎臟組織中的COX水平顯著升高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05），造模時(shí)間越長(zhǎng)，UUO模型組大鼠COX水平越高（P＜0.05），SOD水平越低，見(jiàn)表2。

表2　假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織COX和SOD含量比較

*表示與造模后3d和7d UUO模型大鼠相比，造模后10d、14d和21d UUO模型大鼠具有顯著差異。

2.3假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)比較：與假手術(shù)組大鼠相比，UUO模型組大鼠造模后10d、14d和21d，腎臟組織RIF指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。此研究結(jié)果表明，UUO模型組大鼠腎臟組織已經(jīng)高度纖維化，造模時(shí)間越長(zhǎng)，纖維化程度越高，見(jiàn)表3。

表3　假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)比較

2.4假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎體比、腎功能和腎組織Hyp含量動(dòng)態(tài)變化比較：UUO模型大鼠生長(zhǎng)緩慢，毛雜亂無(wú)章，活動(dòng)能力差，尿多等，造模兩周后，部分大鼠出現(xiàn)一過(guò)性后肢腫脹、行動(dòng)障礙、腎臟明顯腫大、腎體比明顯升高且一直維持在較高水平（P＜0.05）。造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型大鼠血清Scr和BUN水平及腎組織Hyp含量水平逐漸升高，與假手術(shù)組相比均具有顯著差異（P＜0.05）。此研究結(jié)果表明，UUO模型大鼠腎臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，見(jiàn)表4。

表4　假手術(shù)組和UUO模型組大鼠腎體比、腎功能和腎組織Hyp含量動(dòng)態(tài)變化比較

3　討論

慢性腎臟病是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為威脅公共健康的五大慢性疾病之一。慢性腎臟疾病的主要病理基礎(chǔ)是腎纖維化[3]。研究表明，腎纖維化早期是可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)的，尤其是腎小管和腎間質(zhì)，具有潛在的自我修復(fù)功能，有可能逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化[4]。

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎衰竭的共同途徑和共同病理特點(diǎn)，是腎臟結(jié)構(gòu)破壞的最終共同通路，主要表現(xiàn)為腎小管的萎縮和間質(zhì)毛細(xì)血管破壞、腎小管上皮細(xì)胞（renal tubularepithelial cell，RTEC）轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞增生、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的積聚[5，6]。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，可以概括為以下四個(gè)方面：①細(xì)胞損傷及活化，包括腎小管上皮細(xì)胞的損傷和活化、單核巨噬細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞的活化和聚集；②致纖維化因子和促炎因子產(chǎn)生。致纖維化因子主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和某些血管活性物質(zhì)，如血管緊張素II和內(nèi)皮素-1等，促炎因子包括促炎細(xì)胞因子、趨化因子和黏附因子等；③纖維化形成，表現(xiàn)為ECM的產(chǎn)生和降解失衡，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)的沉積；④腎臟結(jié)構(gòu)和功能喪失，表現(xiàn)為腎小管萎縮、毛細(xì)血管稀疏，健存腎單元減少，腎功能減退[7～9]。

RTEC損傷和功能不全是RIF的關(guān)鍵因素和中心環(huán)節(jié)。缺氧性損傷是RTEC損傷的重要因素之一，由于RTEC以高溶轉(zhuǎn)運(yùn)活性為主要特征，這種高溶轉(zhuǎn)運(yùn)活性需要線(xiàn)粒體提供能量。RTEC對(duì)缺氧非常敏感，缺氧可導(dǎo)致RTEC在能量代謝過(guò)程中出現(xiàn)線(xiàn)粒體產(chǎn)生的氧自由基（ROS）明顯增多，ROS與線(xiàn)粒體膜結(jié)合，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性發(fā)生改變，線(xiàn)粒體中的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿中，啟動(dòng)細(xì)胞損傷途徑。因此，ROS的生成及所引起的CytC表達(dá)異常在RTEC損傷中起到十分重要的作用。在線(xiàn)粒體中，ROS通過(guò)complexⅠ和complexⅡ進(jìn)行代謝[10，11]。

RIF的形成過(guò)程非常復(fù)雜，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)相互作用與相互調(diào)節(jié)，最主要病理特點(diǎn)表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生和ECM積聚。ECM的積聚是導(dǎo)致腎臟功能喪失的重要病理特點(diǎn)和因素。氧化損傷能誘導(dǎo)ECM生成和積聚。目前研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷是導(dǎo)致RIF的關(guān)鍵病理因素。UUO是RIF的經(jīng)典模型，具有構(gòu)建方法簡(jiǎn)單、動(dòng)物成活率高、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)。UUO手術(shù)后的腎臟組織血流動(dòng)力學(xué)的改變，進(jìn)而引起組織的缺氧缺血性損傷，導(dǎo)致RIF發(fā)生發(fā)展。因此，探討腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的病理學(xué)機(jī)制具有重要的臨床意義，抗腎纖維化已經(jīng)成為慢性腎臟疾病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[12]。

腎纖維化是指由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟的過(guò)度沉積，病理表現(xiàn)主要有：腎小球硬化、腎小管萎縮和擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化、腎小球和管周血管稀疏。腎纖維化分為腎小球纖維化和腎間質(zhì)纖維化，二者均可導(dǎo)致CKD發(fā)展為腎功能不全，探討腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制、研究抗腎間質(zhì)纖維化的藥物對(duì)慢性腎臟疾病的控制具有重要的意義[13，14]。

本研究項(xiàng)目擬在構(gòu)建腎小管間質(zhì)纖維化（UUO）大鼠模型，以線(xiàn)粒體氧化損傷（包括結(jié)構(gòu)改變與功能障礙、動(dòng)力失衡、再生受抑）啟動(dòng)腎小管腎間質(zhì)纖維化，深入探究腎小管上皮細(xì)胞凋亡致腎小管解離促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的分子細(xì)胞病理機(jī)制，為今后干預(yù)腎小管間質(zhì)纖維化提供思路和途徑。

通過(guò)細(xì)胞組織的超微結(jié)構(gòu)與功能、基因與蛋白的表達(dá)、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)間的Cross Talk，逐層深入揭開(kāi)腎小管線(xiàn)粒體損傷致腎小管解離參與RIF進(jìn)展隱藏的機(jī)制，從嶄新的層面探究有效干預(yù)RIF進(jìn)展的手段（多靶點(diǎn)或是最佳靶點(diǎn)）。

創(chuàng)新性：①?gòu)哪I小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷介導(dǎo)細(xì)胞死亡探討腎小管解離參與RIF進(jìn)展的重要機(jī)制，國(guó)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道、國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。②從線(xiàn)粒體的功能、動(dòng)力平衡、再生探討TGF-β1如何啟動(dòng)線(xiàn)粒體損傷、誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞死亡，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。③從信號(hào)間的“串話(huà)”深究調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡的信號(hào)途徑，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷在腎間質(zhì)纖維化中起著重要的作用，與假手術(shù)組大鼠相比，UUO模型組大鼠腎組織中的線(xiàn)粒體更活躍，線(xiàn)粒體基因、再生基因、斷裂基因和融合基因含量升高，COX含量升高，SOD含量降低，RIF指數(shù)升高，腎體比、血清Scr和BUN和腎組織Hyp水平顯著升高。

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基金編號(hào)：2014科技惠民計(jì)劃，2014S0652

The pathogenic role ofm itochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on kidney interstitial fibrosis

Huang Jiyi Lin Ying Lu Fuhua Zhu Maoshu（Departmentof internalmedicine,the fifth hospital of Xiamen,Xiamen 361000）

Abstract：Objective：This study was undertaken to investigate the pathogenic role of mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on kidney interstitial fibrosis.Methods：The 80 female rats,equally divided into sham-operated group and UUO group, were ligated of the left ureter.The sham-operated group freed the left ureter butwere not ligated and other surgery was the same with the UUO group.8 rats were sacrificed on 3d,7d,10d,14d and 21d in each group separately,and the left kidneys were removed by surgery.①M(fèi)easure and compare themitochondria associated genes between the sham-operated group and the UUO group;②test the level of COX and SOD in the two groups;③measure the RIF index of the kidney;④detect and compare the kidney/body weight,the function of kidney and the level of Hyp in kidney.Results：When compared to the sham-operated group,①the UUO group had a higher level ofmitochondria associated genes such asmtDNA,PGC1a,NRF1,Tfam,Mfn1,Mfn2,Opa1,Drp1 and Fis1（P＜0.05）;②on 10d,14d and 21d,the UUO group had a higher level of COX and a lower level of SOD in kidney,and the level of COX and SOD was timedependent（P＜0.05）;③the UUO group had a higher RIF index on 10d,14d,and 21d（P＜0.05）;④the UUO group had a higher ratio of kidney/body weight,a higher serum level of Scr and BUN,a higher level of Hyp in kidney（P＜0.05）.Conclusions：When compared to the sham-operated group,the UUO group had a much more activemitochondria indicated by the higher level ofmtDNA,regeneration genes,split genes and fused genes,a higher level of COX,a lower level of SOD,it also had a higher level of RIF index,kidney/body weight,a higher level of serum Scr and BUN,a higher level of Hyp in kidney.

Key words：Renal tubular epithelial cells Mitochondria oxidative damage Kidney interstitial fibrosis Pathogenesis

基金項(xiàng)目：△腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)：R692.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）01-0103-03