一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（A D M）制備方法的實驗研究△

王志遠(yuǎn)　王富生　朱偉東（深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院燒傷整形外科　深圳518112）

?

一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（A D M）制備方法的實驗研究△

王志遠(yuǎn)王富生朱偉東（深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院燒傷整形外科深圳518112）

摘要：目的：優(yōu)化實驗條件，建立提取脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的可靠方法。方法：選擇20例包皮環(huán)切術(shù)后切除包皮為研究材料，用胰蛋白酶的消化方式、高滲鹽水分離皮膚表皮，用去垢劑法和胰蛋白酶去除真皮細(xì)胞成分，用組織病理學(xué)，抗原性和生物原性觀察制備后細(xì)胞真皮基質(zhì)進行鑒定。結(jié)果：20例同種異體真皮在組織學(xué)、抗原性及生物原性體征方面符合真皮基質(zhì)的特性。結(jié)論：用酶消化法分離皮膚表皮，用酶消化法祛除真皮細(xì)胞成分，方法可靠，操作簡單，制備脫細(xì)胞基質(zhì)，符合真皮基質(zhì)的特征，制成的真皮基質(zhì)真皮基底膜完整，抗原性小，是理想的組織修復(fù)材料。

關(guān)鍵詞：脫細(xì)胞真皮基質(zhì)生物敷料組織修復(fù)同種異體真皮

大面積深度燒傷需進行皮膚移植修復(fù)創(chuàng)面，自體皮源缺乏是治療大面積燒傷難點，故研究真皮替代物具有重要意義，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（ADM）是近幾年國外興起的一種真皮替代物，是利用特定的方法將皮膚中的細(xì)胞成分去除，僅保留真皮中含膠原網(wǎng)架的細(xì)胞外基質(zhì)。根據(jù)制備材料的來源分為同種異體真皮基質(zhì)（Alloderm）與異種真皮基質(zhì)（Xenoderm）兩種。作為真皮替代物治療全層皮膚缺損的效價在于它的低抗原性、快速血管化和作為表皮載體或支架的穩(wěn)定性，這些特性很大程度上取決于ADM的最終成分。如今ADM的應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出作為單純真皮替代物的范圍，廣泛應(yīng)用于燒傷與整形科等領(lǐng)域。本課題為深圳市龍崗區(qū)科技局立項課題（YL2013164），著重研究酶消化法、高滲鹽法、酶溶解法、去垢劑法進行ADM的實驗室制備。

1　材料和方法

1.1一般資料：本實驗所用20例整形外科切除廢棄包皮組織，研究材料均來自本院整形外科門診和住院病例，所取包皮組織為手術(shù)整形切除組織，標(biāo)本取材前說明目的并征得同意，患者術(shù)前檢查排除傳染性疾病和慢性疾病。包皮組織均來自成年男性，年齡18～38歲，病程18～38年。

1.2標(biāo)本處理：切取過長包皮組織放置在無菌袋中，4℃冰箱保存，術(shù)后環(huán)形遠(yuǎn)端包皮從一側(cè)切口展開，形成平面，用剪刀修剪展開包皮，剪除殘留皮下組織、毛囊等皮膚附屬組織備用。

1.3制備過程

1.3.1表皮和真皮層分離的方法：采用酶消化和高滲鹽水分離法分離表皮和真皮。酶消化法用的消化酶選擇0.25%胰蛋白酶液200mL，放置實驗包皮，置4℃冰箱24h，組織切片染色觀察。高滲鹽水分離法是將標(biāo)本浸泡于1mmol/L氯化鈉200mL溶液中，相同放置條件，利用高滲的原理，使錨著細(xì)絲與表皮基底細(xì)胞的半橋粒分離,從而完整地去除表皮，24h后組織染色切片觀察。

1.3.2去除真皮中細(xì)胞成分的方法

1.3.2.1去垢劑法：去垢劑是一類可溶于水的脂類，它有親水部分和疏水部分，能裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫復(fù)合物。本課題選擇十二烷基硫酸鈉為去垢劑，其在溶液中的穩(wěn)定性高，不易受強電解質(zhì)如無機鹽等的影響，能與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物；同時十二烷基硫酸鈉中的疏水端也能和膜蛋白結(jié)合破壞生物膜,從而使細(xì)胞溶解。該法脫除細(xì)胞徹底，但同時對基底膜結(jié)構(gòu)破壞大不利于上皮細(xì)胞的黏附生長。

1.3.2.2生物酶法：采用胰蛋白酶作為脫細(xì)胞劑，本課題選擇0.25%胰蛋白酶，在此基礎(chǔ)上研究聯(lián)合使用，觀察是否能縮短制作脫細(xì)胞基質(zhì)時間，是否更能促進真皮基質(zhì)的無細(xì)胞化、保留更多的基底膜和降低抗原性。

1.4ADM的鑒定：在物理性質(zhì)，組織學(xué)觀察，抗原性和生物原性觀測，制備ADM進行臨床預(yù)實驗，為今后臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

2　結(jié)果

采用酶消化法及高滲鹽水法分離表皮，用酶消化法和去垢法去除真皮細(xì)胞成分，我們共制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)20例人同種異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，將所得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組織病理學(xué)及抗原性檢測結(jié)果如下：

表1　酶消化法及高滲鹽水法分離表皮

表2　去垢法及酶消化法脫真皮中細(xì)胞成分

表3　郎罕氏細(xì)胞及細(xì)胞染色

3　討論

皮膚移植是救治大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷的關(guān)鍵措施之一，雖然自體皮膚移植是覆蓋全厚皮膚缺損創(chuàng)面的最好方法，但是，大面積燒傷患者的自體皮源常常不足，不得不尋求其他生物敷料，具有機械性和生理性保護作用的異體皮是目前較好的生物敷料，目前脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（allogenic acellular dermalmatrix，allo-ADM）及異種（豬）脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（xenogenic acellular dermal matrix，xeno-ADM）已在臨床應(yīng)用，但異體皮在移植后因機體的排斥反應(yīng)不能長期存活。各種深度燒傷需修復(fù)創(chuàng)面，由于大面積燒傷自體皮源缺乏，造成治療困難，研究真皮材料，對大面積燒傷救治，整形外科填充材料研究具有臨床前景[1]。

皮膚由表皮和真皮組成，表皮為上皮組織，真皮為不規(guī)則的致密結(jié)締組織。表皮由角化的復(fù)層鱗狀上皮組成，分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層和生發(fā)層四層，其中生發(fā)層和角質(zhì)層是表皮基本結(jié)構(gòu)。除復(fù)層鱗狀上皮（角質(zhì)形成細(xì)胞）外表皮還有一類非角質(zhì)形成細(xì)胞，它散在于角質(zhì)形成細(xì)胞之間，如郎格罕斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。真皮位于表皮深層，分為乳頭層和網(wǎng)織層。乳頭層內(nèi)膠原纖維排列不規(guī)則，彈性纖維和網(wǎng)狀纖維含量較少，各類結(jié)締組織細(xì)胞較多，常見有成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、組織細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。網(wǎng)織層由粗大的膠原纖維組成，膠原纖維之間有較多的彈性纖維，即起到真皮支架的作用。皮膚基本結(jié)構(gòu)中表皮和真皮結(jié)構(gòu)中含有上述細(xì)胞成分與免疫密切相關(guān)，這些細(xì)胞表面表達高密度的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子，它們是皮膚的APC，在皮膚移植排斥中發(fā)揮重要的作用，其中最重要的細(xì)胞為郎格罕斯細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。實驗表明，注射郎格罕斯細(xì)胞可明顯加速皮膚移植物排斥和異體角質(zhì)細(xì)胞注入真皮內(nèi)可見明顯的排斥反應(yīng)。由于皮膚功能及再生能力有限，在大面積燒傷患者應(yīng)用全層的豬皮或者尸體的全厚皮膚覆蓋創(chuàng)面起到安全過渡休克期和急性感染期，但是由于移植皮膚內(nèi)的細(xì)胞引起排斥反應(yīng)，異體皮膚不能長期存活。所以設(shè)想從異種或異體真皮內(nèi)除去誘導(dǎo)免疫排異的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞成分,得到保持真皮原有結(jié)構(gòu)、以真皮膠原為主體的低抗原性真皮替代物（DS），可減少或消除異種和異體真皮移植后的排異反應(yīng)，達到上文所述的免疫耐受，以期移植物長期存活。這一設(shè)想首先由Wainwright，Livesey在異體無細(xì)胞真皮基質(zhì)、動物實驗和臨床應(yīng)用方面得到證實，作為網(wǎng)狀自體刃厚皮片載體，獲得較高的成活率，在短期覆蓋創(chuàng)面方面起到很好的作用。國內(nèi)燒傷界同行陳璧[2]，孫永華應(yīng)用異體無細(xì)胞真皮基質(zhì)結(jié)合超薄皮片在大面積燒傷患者，同樣取得較高的生存率和比較滿意的功能。雖然異體無細(xì)胞真皮基質(zhì)移植取得較好的臨床應(yīng)用效果，但由于異體皮膚來源少，近年來,為進一步拓寬真皮替代物來源、擺脫異體皮膚存在的不足因素,人們再一次把目光轉(zhuǎn)向無細(xì)胞異種真皮基質(zhì)的研究應(yīng)用。由于動物實驗存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致創(chuàng)面愈合不良，國外對xeno-ADM仍持有審慎的態(tài)度，但國內(nèi)已過渡到臨床應(yīng)用上。通過反復(fù)凍融法，滲透溶液法，酶消化法和化學(xué)去污劑法等脫細(xì)胞法脫去異種真皮組織內(nèi)含有大量抗原性較強的細(xì)胞成分,包括附件上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、郎格漢斯細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。脫細(xì)胞后，真皮剩余的大部分為低抗原性非細(xì)胞成分，主要包括基質(zhì)蛋白和膠原，但是仍會殘留的免疫原性較強細(xì)胞膜抗原和基質(zhì)蛋白，從而引起較強的免疫排斥反應(yīng)[3]。

本課題研究從廢棄包皮中制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，并在實驗條件下探索制備方法，為進一步研究同種異體生物真皮替代物生物特性。從本課題用胰蛋白消化法、高滲鹽溶液分離包皮表皮，實驗發(fā)現(xiàn)酶消化法真皮分離完整，組織學(xué)觀察，基底膜完整[4]，而高滲鹽法表皮分離有表皮殘留，基底膜基本完整，此觀察與方林森等[5]，采用高滲鹽-胰蛋白酶法制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)研究結(jié)果相符，采用高滲鹽-胰蛋白酶法制備脫細(xì)胞基質(zhì)方法達到既能脫去表皮層細(xì)胞成分，又使基底膜完整連續(xù)，膠原彈力纖維結(jié)構(gòu)及排列正常的雙重目的，ADM柔韌性好、不斷裂、無細(xì)菌生長。但分離表皮后，真皮中存在細(xì)胞成分，尤其是郎罕氏細(xì)胞，是發(fā)生排除反應(yīng)主要成分，先期組織學(xué)電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中可見到細(xì)胞成分，需進一步處理，制備具有完全脫細(xì)胞成分真皮基質(zhì)，用去垢劑法和酶消化法再次進行脫細(xì)胞處理，組織學(xué)電鏡染色觀察，兩種方法均可以去除95%以上細(xì)胞成分，尤其是胰蛋白酶法不但能去除真皮成分，而且能保留真皮基底膜完整，去垢劑法去除細(xì)胞效果與胰蛋白酶法基本一致[6]，但觀察發(fā)現(xiàn)基底膜完整性有差別。用去垢劑（十二烷基硫酸鈉）、胰蛋白酶等去除真皮中細(xì)胞成分，能完全去除真皮細(xì)胞成分，不改變真皮中彈力纖維和膠原纖維的結(jié)構(gòu)，制備工藝可操作性強，是一種簡單有效的制備方法。

4　結(jié)　論

用酶消化法分離皮膚表皮，用酶消化法除去真皮細(xì)胞成分，方法可靠，操作簡單，制備脫細(xì)胞基質(zhì)，符合真皮基質(zhì)的特征，制成的真皮基質(zhì)真皮基底膜完整，抗原性小，是理想的組織修復(fù)材料。

參考文獻

[1]馬紹英，李寶興，賴熾香，等.無細(xì)胞真皮基質(zhì)的研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2007，36（4）：313.

[2]姜篤銀，陳璧，徐明達，等.異種脫細(xì)胞基質(zhì)的制作和臨床應(yīng)用觀察[J].中華燒傷雜志，2002，18（1）：15-18.

[3]史新立，譚芳奕，陳冰.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的材料的研究及應(yīng)用[J].中華損傷與修復(fù)雜志（電子版），2009，4（4）：55-56.

[4]伍津津，朱堂友，魯元剛，等.表皮真皮分離方法的探索[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，26（24）：2242-2244.

[5]方林森，王春華，胡德林，等.制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的實驗研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，40（1）：20-22.

[6]車鵬程，孫紅，劉麗，等.三種無細(xì)胞基質(zhì)制備方法的比較[J].山東醫(yī)藥，2008，48（35）：101-102.

基金項目：△深圳市龍崗區(qū)科技局基金（YS2013142）。

中圖分類號：R622

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）01-0100-02