玉米磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆及原核表達(dá)

馬芳芳，蘇彥冰，張彬，李紅英，韓淵懷

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原 030031)

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玉米磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆及原核表達(dá)

馬芳芳1，2，蘇彥冰1，2，張彬1，2，李紅英1，2，韓淵懷1，2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原 030031)

摘要：為克隆玉米(ZeamaysL.)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因ZmTPI，并進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)研究，根據(jù)玉米TPI基因的cDNA全長序列設(shè)計特異引物，以玉米葉片總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到了約750 bp的基因編碼區(qū)cDNA片段，T/A克隆后進(jìn)行了序列測定及序列分析，隨后將克隆到的該基因片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1上，得到的重組表達(dá)質(zhì)粒GST-ZmTPI轉(zhuǎn)化Bl21進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。結(jié)果顯示，玉米ZmTPI(GenBank：EU959275)cDNA全長1 216 bp，753 bp開放閱讀框編碼250個氨基酸，推測分子量26.7205 kDa，理論等電點為5.12；該蛋白具有高度保守的TIM結(jié)構(gòu)域，與其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性；進(jìn)化樹分析表明，玉米TPI與甘蔗親緣關(guān)系最近，處于同一進(jìn)化支；SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，成功誘導(dǎo)表達(dá)并且純化了與預(yù)期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表達(dá)及純化的成功，為進(jìn)一步研究目的蛋白的酶活性質(zhì)及生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米； 磷酸丙糖異構(gòu)酶； 基因克??； 原核表達(dá)

磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase，TPI)能夠催化二羥丙酮磷酸(DHAP)和D型甘油醛-3-磷酸(GAP)這兩種丙糖磷酸異構(gòu)體之間的可逆轉(zhuǎn)換[1,2]，作為糖酵解及糖異生途徑中的關(guān)鍵酶，TPI被發(fā)現(xiàn)幾乎存在于所有的生物體當(dāng)中[3,4]。光合生物的TPI通常含有兩種亞型，分別存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。位于細(xì)胞質(zhì)的胞質(zhì)型TPI(cTPI)參與糖酵解，而位于葉綠體的質(zhì)體型TPI(pTPI)則參與了卡爾文循環(huán)[5]。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，TPI經(jīng)常被鑒定為是谷胱甘肽化和亞硝基化的潛在靶標(biāo)，表明它的活性在脅迫條件下可以通過半胱氨酸修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)[6～10]。由于TPI在植物生長發(fā)育過程中對于能量的有效生成是必不可少的，近年來國內(nèi)外關(guān)于TPI相關(guān)功能的研究備受關(guān)注。目前來自不同生物的TPI結(jié)構(gòu)特點和功能已經(jīng)被廣泛研究[11～15]。Dorion等研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯生長過程中，葉片cTPI對于生物合成過程中能量的生成、碳的代謝等方面起著重要的作用[16]。Salekdeh等通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明水稻TPI在干旱脅迫條件下，其表達(dá)量上調(diào)了30%～40%[17]。Ito 等認(rèn)為擬南芥TPI 作為谷胱甘肽化靶酶在糖代謝途徑中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[7]。課題組前期研究工作中，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選玉米葉片cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了一個與ZmMPK5相互作用蛋白(未發(fā)表的數(shù)據(jù))，經(jīng)鑒定該蛋白屬于玉米胞質(zhì)型TPI(GenBank：EU959275)，本文命名為ZmTPI。推測該蛋白可能與ZmMPK5相互作用，在植物的生長發(fā)育及代謝過程中起作用。目前國內(nèi)外關(guān)于玉米TPI的研究鮮有報道，本研究以獲得的ZmTPI序列為基礎(chǔ)，擬通過對該蛋白進(jìn)行基因克隆、序列分析以及原核表達(dá)及純化，為進(jìn)一步探索研究玉米TPI 的生理生化功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1植物材料

以玉米(ZeamaysL.)雜交種農(nóng)大108為材料，將種子浸泡12 h，25 ℃催芽48 h后播于含有營養(yǎng)液的沙土中培養(yǎng)，當(dāng)幼苗第二片真葉完全展開時，剪取第二片葉，迅速置于液氮中冷凍保存。

1.1.2菌株和載體

大腸桿菌菌株E.coli DH5α、Bl21由本實驗室保存；pMD19-T Vector購自TaKaRa寶生物(大連)生物工程有限公司； pGEX-4T-1(Novagen, Inc., Madison, WI, USA)由本實驗室保存。

1.1.3主要試劑

氨芐青霉素、IPTG為Sigma公司產(chǎn)品；DNA polymerase、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA快速回收純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；PlatinumPfxDNA Polymerase購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa寶生物(大連)生物工程有限公司；High-Affinity GST Resin購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2ZmTPI基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中ZmTPI基因(序列號：ACG31393)的全長cDNA序列，設(shè)計并合成引物：TPI-F：5′-GAATTC ATGGGCCGCAAGTTCTTCGT-3’；TPI-R：5’-CTCGAGCACGGTGGCGGCGTTGATGAT-3’。為了便于后續(xù)載體的構(gòu)建，引物設(shè)計時分別在正、反向引物中添加了EcoRI和XhoI酶切位點(下劃線部分)。

提取玉米葉片總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。利用上述引物并以合成的cDNA為模板擴(kuò)增ZmTPI的編碼區(qū)(ORF)片段。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將得到的PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切取目的條帶進(jìn)行膠回收與產(chǎn)物純化。純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為 T-ZmTPI。

1.3ZmTPI序列分析

基因核苷酸和氨基酸同源序列的查找和比對主要在NCBI、ExPASy等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行，采用BLAST程序完成；氨基酸、蛋白分子量、等電點分析由ExPASy在線分析軟件ProtParam完成；結(jié)構(gòu)域分析由Pfam在線分析軟件完成；多序列比對由CLUSTAL-X軟件結(jié)合BOXSHADE在線工具完成；聚類分析由MEGA 3軟件完成，采用Neighbor-joining方法進(jìn)行1 000次Bootstrap重復(fù)檢測。

1.4ZmTPI原核表達(dá)載體的構(gòu)建

分別將重組質(zhì)粒T-ZmTPI和載體質(zhì)粒pGEX-4T-1進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收ZmTPI目的片段以及載體大片段，經(jīng)連接反應(yīng)，使ZmTPI片段插入到pGEX-4T-1的相應(yīng)酶切位點之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)篩選、鑒定并測序后，獲得含有ZmTPI編碼區(qū)插入方向和閱讀框均正確的重組原核表達(dá)載體，命名為GST-ZmTPI。

1.5融合蛋白的表達(dá)及純化

表達(dá)：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒GST-ZmTPI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)；挑單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌過夜；按1∶100比例接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2～3 h，至OD600約0.6。加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)一定的時間(2 h、4 h 、6 h)；4 ℃，8 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，加入3 mL 預(yù)冷的PBS(PH 7.5)重懸；超聲破碎細(xì)胞壁，至菌體懸液由混濁變?yōu)槌吻?破壁前，在細(xì)胞懸液中加入PMSF至終濃度為1 mmol·L-1)；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，吸取適量用于SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況。

純化：參照High-Affinity GST Resin說明書，將上述收集的GST-ZmTPI融合蛋白細(xì)胞裂解液上清加入親和層析柱，與1 mL 50% Glutathione Sepharose輕柔混勻后， 4 ℃孵育結(jié)合，之后用20倍柱床體積的PBS洗去未結(jié)合蛋白，用10倍柱床體積的新鮮配置的還原型谷胱甘肽洗脫液進(jìn)行洗脫；即為純化后的融合蛋白。取適量洗脫液，加入蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴煮5 min，跑SDS-PAGE，檢測蛋白純化情況。

2結(jié)果與分析

2.1ZmTPI基因的克隆

提取玉米葉片總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以cDNA為模板并利用設(shè)計的特異引物擴(kuò)增ZmTPI的編碼區(qū)(ORF)片段。將得到的PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1，可以看到在753 bp位置有一條單一目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。切取目的條帶進(jìn)行膠回收與產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果表明，得到了與預(yù)期結(jié)果相符的序列正確的重組質(zhì)粒，并將其命名為T-ZmTPI。

2.2ZmTPI序列分析

ZmTPI(序列號：ACG31393)cDNA全長1 216 bp，753 bp的開放閱讀框(ORF)編碼250個氨基酸殘基，推測相對分子質(zhì)量為26.7205 kDa，等電點為5.12。具有完整的TIM保守功能域，屬于TIM phosphate binding超家族成員。

利用Clustal X軟件結(jié)合BoxShade在線工具，將ZmTPI與其它植物TPI蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對分析(圖2)，每一個序列中都含有TIM的催化殘基，即酶的活性中心(Asn 10, Lys 12, His 96, Glu 166)，以及保證底物與活性中心緊密結(jié)合的特征保守基序(164-AYEPVWAIGTG-174)。玉米ZmTPI與其它植物的TPI蛋白具有非常高的相似性，與甘蔗的TPI同源性高達(dá)到93%，與水稻、小麥、馬鈴薯、擬南芥、大豆的TPI蛋白分別有87%、86%、84%、81%、81%的同源性。

為了研究ZmTPI蛋白氨基酸序列與其它植物TPI蛋白系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，本文選取Genbank中一些已知的ZmTPI同源氨基酸序列，利用MEGA 3軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示，玉米ZmTPI與甘蔗、水稻、大麥等的親緣關(guān)系較近，與菠菜的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

2.3ZmTPI原核表達(dá)載體的構(gòu)建

為了進(jìn)行原核表達(dá)試驗，分別將重組質(zhì)粒T-ZmTPI和載體質(zhì)粒pGEX-4T-1進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收ZmTPI目的片段以及載體大片段，經(jīng)連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒。EcoRI和XhoI雙酶切鑒定結(jié)果表明(圖4)，在753 bp左右目的條帶位置切出了與預(yù)期結(jié)果相符的單一片段，說明ZmTPI的ORF片段已成功插入到載體pGEX-4T-1的相應(yīng)酶切位點之間。測序結(jié)果也表明，ZmTPI編碼區(qū)在載體中的插入方向以及讀碼框均正確，說明已成功構(gòu)建可以融合表達(dá)GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒GST-ZmTPI。

2.4融合蛋白的表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的GST-ZmTPI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Bl21，經(jīng)28 ℃，0.1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h、4 h 、6 h后將細(xì)菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測其表達(dá)情況，結(jié)果如圖5 (a) 顯示，在約53 kD左右的位置處形成一深染蛋白條帶，與預(yù)期的GST-ZmTPI融合蛋白大小基本一致(其中GST標(biāo)簽蛋白為26 kD，ZmTPI推測分子量約27 kD，因此誘導(dǎo)出的目的融合蛋白的分子量為GST蛋白與ZmTPI蛋白的分子量之和)。并且隨著時間的延長，融合蛋白的表達(dá)量也有逐漸增加的趨勢。誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，最終收集菌體，經(jīng)超聲破碎后收集上清，通過親和層析柱，利用GST和還原型谷胱甘肽(GSH)之間酶-底物的特異性親和作用對細(xì)菌裂解液中的GST-ZmTPI融合蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖5 (b) 顯示，在目的位置得到唯一的一條蛋白條帶，說明純化效果理想。

3討論與結(jié)論

磷酸丙糖異構(gòu)酶在原核生物和真核生物中普遍存在，并且在糖酵解、糖異生、脂肪酸合成以及戊糖磷酸途徑等途徑中起著關(guān)鍵作用。TPI通常被認(rèn)為是一個極其高效的酶，甚至被稱為是一個完美的催化劑[2]。TPI的缺乏或酶活性的降低可以導(dǎo)致機(jī)體一系列生理及代謝上的改變[18]。在人類中，基因突變引起的中度至重度TPI活性下降可導(dǎo)致溶血性貧血及急性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[19]。擬南芥pTPI基因缺失突變體pdtpi，由于積累的DHAP導(dǎo)致甲基乙二醛的毒害而表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長發(fā)育受阻，表明質(zhì)體型TPI在幼苗生長過程中的葉綠體發(fā)育以及從自養(yǎng)到異養(yǎng)的代謝轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要功能[20]。Dorion等對轉(zhuǎn)基因馬鈴薯根的研究結(jié)果表明，胞質(zhì)TPI的大量減少改變了植物初級代謝過程中碳的分布情況[21]。TPI很可能在植物受到脅迫時也起到重要的作用，已有研究表明cTPI與蕨類植物蜈蚣草的砷抗性相關(guān)[22]，缺鐵脅迫條件下擬南芥TPI可以被誘導(dǎo)表達(dá)[23]。然而在玉米中，關(guān)于TPI的研究鮮有報道。

實驗室前期通過篩選玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫，得到了玉米中的一個胞質(zhì)型TPI(GenBank：EU959275)，為了深入了解它的生化特性及功能，我們在獲得玉米TPI基因cDNA全長序列的基礎(chǔ)上設(shè)計特異引物，以玉米葉片總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到了約750 bp的與預(yù)期大小相符的基因編碼區(qū)cDNA片段，T/A克隆后進(jìn)行了序列測定。結(jié)果顯示，成功克隆了玉米ZmTPI。該基因753 bp開放閱讀框編碼250個氨基酸，推測分子量26.720 5 kDa，理論等電點5.12。

真核生物的TPI起源于α-變形菌，具有較高的保守性，被廣泛應(yīng)用于物種間基因的起源與進(jìn)化研究[24,25]。本研究利用生物信息學(xué)軟件對ZmTPI進(jìn)行了多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸序列具有典型的高度保守的TIM功能結(jié)構(gòu)域，與其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性，并且具有TIM 所共有的活性中心氨基酸及保守基序。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，玉米ZmTPI與甘蔗的親緣關(guān)系最近，處在同一進(jìn)化枝，與菠菜的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律。序列比對及進(jìn)化樹分析，使我們可以對不同物種TPI同源基因起源進(jìn)化的相互關(guān)系以及可能行使的功能做一定的預(yù)測，為進(jìn)一步研究該基因分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

通過表達(dá)克隆基因所編碼的蛋白質(zhì)，能夠為我們探索和研究該基因的結(jié)構(gòu)與功能提供基礎(chǔ)。本研究將ZmTPI克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒GST-ZmTPI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Bl21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出與預(yù)期大小基本一致的GST-ZmTPI融合蛋白。通過親和層析柱，對細(xì)菌裂解液中的GST-ZmTPI融合蛋白進(jìn)行了純化，得到了純化效果理想的目的蛋白，為研究其生化特性提供了材料。

綜上所述，本研究從玉米葉片中成功克隆了ZmTPI基因編碼區(qū)序列并對該序列進(jìn)行了分析。同時成功構(gòu)建了GST-ZmTPI 重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白，并對該融合蛋白進(jìn)行了純化，為下一步深入研究ZmTPI的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

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(編輯：馬榮博)

Cloning and prokaryotic expression ofTPIgene in maize

Ma Fangfang1,2, Su Yanbing1,2, Zhang Bin1,2, Li Hongying1,2, Han Yuanhuai1,2

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China)

Key words:Maize； Triosephosphate isomerase； Gene cloning； Prokaryotic expression

Abstract:ZmTPIgene cloned fromZeamayswas expressed inE.coliBl21. In this work, based on the full-length cDNA sequences of maizeTPIgene, a cDNA coding region fragment about 750 bp was amplified using RT-PCR method from total RNA of maize leaves and cloned into the prokaryotic expression vector PGEX-4T-1, resulting the recombinant plasmid of GST-ZmTPI. The resulting construct GST-ZmTPI was then transformed intoE.coliBl21 for further analysis. Results showed that theZmTPI(GenBank: EU959275) cDNA sequence is 1 216 bp in length and has an open reading frame (ORF) of 753 nucleotides, encoding a protein of 250 amino acids with a predicted molecular mass of approximately 26.7205 kDa polypeptide and an isoelectric point of 5.12; The ZmTPI protein has highly conserved TIM domain, and was highly similar with its homologous proteins in other plants; phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequence of ZmTPI was most similar to that ofSaccharumofficinarum, indicating that they belong to the same evolutionary branch; SDS-PAGE assay showed that the fusion protein was successfully expressed and purified with the expected size. TheZmTPIgene was cloned and successfully expressed and purified inE.coliBl21. This study will provide a foundation for further research on biological function of this protein.

收稿日期：2016-03-16 修回日期：2016-04-01

作者簡介：馬芳芳(1984-)，女(回)，山西長治人，講師，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物學(xué)

基金項目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金(2013YJ04)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014022、2014YZ2-5)

中圖分類號：S513；Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)06-0381-06