慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/CP區(qū)變異研究進(jìn)展*

黃鵬宇綜述，徐東平審校

慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/CP區(qū)變異研究進(jìn)展*

黃鵬宇綜述，徐東平審校

慢加急性肝衰竭（ACLF）是我國肝衰竭的主要類型，其病情發(fā)展迅速、預(yù)后不良、病死率較高。在我國，乙型肝炎病毒（HBV）感染是導(dǎo)致ACLF的主要病因，其中HBV前C（PC）/核心啟動(dòng)子（CP）區(qū)基因變異與ACLF的發(fā)生密切相關(guān)。本文重點(diǎn)介紹HBV PC/CP區(qū)基本結(jié)構(gòu)和功能、PC/CP區(qū)變異后生物學(xué)特性的改變、ACLF的免疫病理損傷機(jī)制、PC/CP區(qū)變異與ACLF疾病進(jìn)展的臨床意義等方面的研究進(jìn)展。

慢加急性肝衰竭；乙型肝炎病毒；前C區(qū)；核心啟動(dòng)子；變異

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的傳染病，HBV感染是全球公共健康問題。我國約有慢性HBV感染者9300萬人，2000萬慢性乙型肝炎患者[1]。HBV感染可進(jìn)展為慢性乙型肝炎、肝硬化（Liver cirrhosis，LC）、肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝衰竭。肝衰竭可分為急性、亞急性、慢加急性和慢性肝衰竭，其中慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）是臨床最為常見的肝衰竭，是在慢性肝病的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償，我國的ACLF患者主要是由HBV感染所引起的[2]，ACLF為臨床獨(dú)特的肝病危重疾病，病情發(fā)展迅速,預(yù)后不良，死亡率高達(dá)50%～80%[3]，其具體的發(fā)病機(jī)制未完全明確,可能與以下幾個(gè)方面因素相關(guān)[4]：1.宿主的免疫學(xué)因素；2.宿主的遺傳易感因素；3.病毒基因變異等病毒學(xué)因素；4.病毒基因變異引起的機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)狀態(tài)改變是肝衰竭的重要發(fā)生因素[5,6]，與肝臟病情惡化密切相關(guān)[7]。其中，HBV前C（Procore， Pre-C）/核心啟動(dòng)子（Core promoter,CP）區(qū)變異對病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制和表達(dá)可產(chǎn)生明顯影響，進(jìn)而影響疾病進(jìn)展，并可能在特定環(huán)境下成為ACLF的始動(dòng)因素，與ACLF的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)。本文將對HBV前C/CP區(qū)的結(jié)構(gòu)及功能、前C/CP區(qū)變異后生物學(xué)特性的改變以及免疫學(xué)和病毒學(xué)因素對ACLF發(fā)生的影響等方面進(jìn)行一系列的闡述。

1 HBV前C/CP區(qū)的基本結(jié)構(gòu)及功能

HBV基因結(jié)構(gòu)為部分雙鏈的環(huán)狀DNA，其基因組全長約為3.2kb。HBV DNA基因組由四個(gè)開放的讀碼框（Open reading frame,ORF）組成，分別為S基因（前S1、前S2及S區(qū)）、P基因、X基因、C基因區(qū)（前C及C區(qū)）。其中，前C基因區(qū)（nt1814-nt1900），為C-ORF的一部分。由29aa個(gè)氨基酸多肽組成，前C區(qū)產(chǎn)物的氨基酸端是非結(jié)構(gòu)的信號肽，使后續(xù)的結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，前C區(qū)轉(zhuǎn)錄的前C mRNA形成HBeAg的前體蛋白，解脫信號肽和羧基端的一些殘基后，形成分子量不等的HBeAg群體，向細(xì)胞外分泌，具有編碼HBeAg的功能。CP區(qū)（nt1575-1849）包含有基本核心啟動(dòng)子區(qū)（BCP，nt1743-1849）和上游調(diào)控區(qū)（URR，nt1613-1742）等功能區(qū)域，其中BCP區(qū)的功能較為重要，參與調(diào)控3.5kb HBV pgRNA和preC mRNA的轉(zhuǎn)錄起始。pgRNA是聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄和C蛋白合成的模板[8]，CP區(qū)對調(diào)控pgRNA的合成以及HBV復(fù)制中起重要的作用[9]。

HBV在復(fù)制過程中，由于HBV DNA聚合酶缺乏讀碼校正功能，在宿主免疫、藥物等各種外界壓力作用下，其相關(guān)基因也將發(fā)生各種變異，以確保其生物學(xué)優(yōu)勢，其中在前C/ CP區(qū)出現(xiàn)的變異與ACLF的發(fā)生密切相關(guān)[10]。

2 HBV前C/CP區(qū)變異后生物學(xué)特性的改變

當(dāng)前C/CP區(qū)出現(xiàn)變異時(shí)，常伴有重要的生物學(xué)活性（包括：HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBV DNA和啟動(dòng)子活性）的改變。

2.1前C區(qū)變異后生物學(xué)特性的改變前C區(qū)內(nèi)含有一個(gè)發(fā)卡的ε干襻結(jié)構(gòu)，ε干襻結(jié)構(gòu)是病毒的包裝信號，它的功能是與P蛋白結(jié)合包裝前基因組RNA，引導(dǎo)基因組的復(fù)制。在這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，1850A與1904G、1855T與1899G、1858T與1896G這3對核苷酸互不配對，這是這些位點(diǎn)發(fā)生基因變異的重要分子基礎(chǔ)[11]。

由Carman et al[12]首先證實(shí)，在HBV前C區(qū)中最常見的變異為G1896A，該變異可使28為色氨酸編碼單位（TGG）變?yōu)榻K止密碼（TAG），使HBeAg合成的提前終止，HBeAg的合成、表達(dá)減少。HBeAg能緩解細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）對細(xì)胞膜上HBcAg的攻擊，當(dāng)HBeAg合成或分泌障礙時(shí)，CTL容易攻擊感染的肝細(xì)胞，造成嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷。此外，G1896A變異還增加HBV莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使HBcAg的表達(dá)增加，HBcAg在肝細(xì)胞內(nèi)的分布由核型轉(zhuǎn)變成胞質(zhì)型，增加了其對肝細(xì)胞的毒性[13]。前C區(qū)G1896A變異還能使血清γ干擾素（IFN-γ）增高，IFN-γ可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞，促進(jìn)產(chǎn)生IL-26等細(xì)胞因子誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[14]。因此，前C區(qū)變異后出現(xiàn)的HBeAg轉(zhuǎn)陰在特定條件下有可能引起更嚴(yán)重的肝臟疾病。

本課題組任曉強(qiáng)[15]對958例乙肝患者，其中包括399例輕中度慢性乙型肝炎、211例重度慢性乙型肝炎和348例慢性重型乙型肝炎患者，對958例患者HBV前C/CP區(qū)序列的10個(gè)熱點(diǎn)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著病情加重，有T1753、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899等8個(gè)位點(diǎn)變異頻率顯著增加，其中5個(gè)位點(diǎn)的變異發(fā)生率隨病情加重呈現(xiàn)階梯式上升特點(diǎn)，推測前C/BCP區(qū)多個(gè)位點(diǎn)變異的積累是慢性乙型肝炎重型化進(jìn)程中的基礎(chǔ)病毒學(xué)因素。此外，前C/BCP區(qū)多聯(lián)變異和插入/缺失突變的發(fā)生率在病情加重時(shí)也明顯增加，其中三聯(lián)變異率隨疾病加重呈逐漸升高的趨勢，表明這一區(qū)域多位點(diǎn)變異發(fā)生頻率的增加與疾病重癥化進(jìn)程密切相關(guān)。

2.2 CP區(qū)變異后生物學(xué)特性的改變CP區(qū)屬于非編碼區(qū)，包含DR1區(qū)、前C和C基因的2種mRNA起點(diǎn)，其對pgRNA的轉(zhuǎn)錄起重要的調(diào)控作用。同時(shí)，CP區(qū)為多種肝細(xì)胞核內(nèi)因子的結(jié)合部位，為病毒轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和正鏈合成的起點(diǎn)，也是HBV DNA復(fù)制的重要調(diào)節(jié)區(qū)[16]。陳風(fēng)娟[17]對肝細(xì)胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）與肝臟疾病研究進(jìn)行了綜述，對乙型病毒性肝炎患者進(jìn)行肝穿刺發(fā)現(xiàn)：肝穿刺組織中HNF4α表達(dá)量與HBsAg，HBcAg和HBV DNA的表達(dá)量呈正相關(guān)，證明HNF4α支持HBV的復(fù)制；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝細(xì)胞核內(nèi)因子對HBV復(fù)制的增強(qiáng)作用主要是通過與HNF4α結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的，提示HNF4α為HBV前基因組RNA合成和病毒復(fù)制所必需，且是一個(gè)正性作用的調(diào)控因子，是病毒嗜肝性的主要決定因子。因此，當(dāng)CP區(qū)出現(xiàn)病毒變異和肝細(xì)胞核因子高表達(dá)時(shí)，可能促使病毒基因的表達(dá)升高，使HBV DNA的復(fù)制力增強(qiáng)從而加速疾病重癥化的進(jìn)展。

BCP區(qū)內(nèi)有T1753A/C、T1754C/G、T1758C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A等熱點(diǎn)變異位點(diǎn)在ACLF患者中出現(xiàn)較多。其中以A1762T（亮氨酸變?yōu)榈鞍彼幔┖虶1764A（纈氨酸變?yōu)榱涟彼幔┞?lián)合變異最為常見，Okamoto等首先[18]發(fā)現(xiàn)在BCP區(qū)中A1762T和G1764A兩位點(diǎn)變異可形成HBeAg陰性CHB，兩位點(diǎn)聯(lián)合變異在無癥狀HBeAg陽性患者中很少出現(xiàn)；而在重癥HBV患者中的變異發(fā)生率卻很高，其在重癥HBV發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。功能實(shí)驗(yàn)顯示A1762T和G1764A聯(lián)合變異會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子與BCP區(qū)的結(jié)合發(fā)生改變，使pre-C mRNA的轉(zhuǎn)錄降低從而導(dǎo)致HBeAg水平的下降，但不影響前基因組RNA和HBV DNA水平，可提高病毒復(fù)制力水平，使變異后的病毒復(fù)制力高于野生株[19，20]。其原因可能為：一方面CP區(qū)聯(lián)合變異時(shí)與HNF-4核因子的結(jié)合能力增強(qiáng)，pgRNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，促進(jìn)pgRNA的衣殼化，增加HBcAg的表達(dá)，從而使病毒復(fù)制力增強(qiáng)[21]。另一方面，A1762T/G1764A和其他CP區(qū)內(nèi)的變異，可能改變pgRNA的二級結(jié)構(gòu)，從而形成松散的莖襻結(jié)構(gòu)，在逆轉(zhuǎn)錄的過程中易被打開。最近研究發(fā)現(xiàn)，前CP區(qū)變異還與HBV X基因區(qū)、前S（Pre-surface）和CP區(qū)堿基的缺失、插入突變等因素密切相關(guān)。當(dāng)CP區(qū)出現(xiàn)缺失或變異時(shí)會(huì)影響HBV的轉(zhuǎn)錄活性以及HB X基因區(qū)的完整性，可能與疾病重癥化的進(jìn)展密切相關(guān)[22]；同時(shí)，前S區(qū)發(fā)生缺失聯(lián)合CP區(qū)出現(xiàn)的變異是預(yù)測終末期肝病的重要指標(biāo)[23]。

CP區(qū)出現(xiàn)重要位點(diǎn)的變異被視為影響啟動(dòng)子活性及HBV DNA復(fù)制的主要因素之一[24]，且多聯(lián)變異的影響要高于雙聯(lián)變異。本課題組王耀[25]對40例慢性乙肝患者與40例慢加急性肝衰竭患者進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G1764A/C1766T/ T1768A三聯(lián)變異在CHB患者中為0.0%（0/40）；在ACLF患者中為12.5%（5/40）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示：典型BCP區(qū)雙聯(lián)變異A1762T/G1764A病毒株的啟動(dòng)子活性較野生株的提高了1.67倍，復(fù)制力為野生株的1.56倍。而G1764A/C1766T/ T1768A三聯(lián)變異病毒株的啟動(dòng)子活性為相應(yīng)野生株的1.43～1.80倍，復(fù)制力為野生株的1.54～2.85倍。結(jié)果表明BCP區(qū)內(nèi)的多聯(lián)變異的影響高于雙聯(lián)變異，雙聯(lián)及多聯(lián)變異能順式激活下游基因轉(zhuǎn)錄活性的作用，從而增強(qiáng)病毒的復(fù)制力，隨著疾病進(jìn)展加重其累積變異位點(diǎn)明顯增多[26]。

3免疫學(xué)因素對ACLF發(fā)生的影響

肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致肝臟的合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)凝血機(jī)制障礙、轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸、腹水和肝性腦病等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群[27]。在我國，發(fā)生ACLF的主要病因是由HBV感染所引發(fā)的。ACLF的發(fā)生和發(fā)展主要受宿主免疫和病毒變異等因素的相互作用的影響。其中，病毒變異誘發(fā)的機(jī)體免疫損傷是引起肝衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要因素[28]。

乙型肝炎病毒并不直接引起肝細(xì)胞的損傷，在人體感染HBV后，患者在受到勞累、酒精、病毒變異、肝損害藥物等誘因的刺激下，通過引發(fā)人體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，從而激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致病變的肝細(xì)胞產(chǎn)生或釋放大量異常的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)免疫損害加重，使病情不斷發(fā)展。其中，HBV引發(fā)的免疫損傷以細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔。ACLF是機(jī)體免疫系統(tǒng)對HBV的過激應(yīng)答反應(yīng)，CTL的特異性損傷、炎癥細(xì)胞因子的大量增多引起的急性炎性反應(yīng)以及各種免疫活性細(xì)胞引發(fā)非特異性損傷是誘發(fā)ACLF的主要因素，機(jī)體的免疫反應(yīng)決定著ACLF疾病的轉(zhuǎn)歸[29]。

4前C/CP區(qū)變異對ACLF發(fā)生的影響

HBV感染的結(jié)局取決于病毒、宿主和機(jī)體免疫之間的相互作用。當(dāng)重要的基因區(qū)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病毒變異時(shí)，這個(gè)三者之間的平衡關(guān)系被打破。前C區(qū)發(fā)生變異時(shí)可產(chǎn)生HBeAg陰性慢性乙型肝炎，失去HBeAg的免疫調(diào)節(jié)，CTL易誘導(dǎo)感染的肝細(xì)胞凋亡，加重機(jī)體免疫反應(yīng)，造成肝細(xì)胞損傷；而發(fā)生在CP區(qū)的變異可使病毒的復(fù)制力增強(qiáng)。因此，當(dāng)前C/CP區(qū)出現(xiàn)聯(lián)合變異時(shí)，機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)被打破，可造成肝細(xì)胞在短期內(nèi)大量壞死，導(dǎo)致病情急劇加重，出現(xiàn)重型肝炎甚至肝衰竭，死亡率較高[30]。

本課題組Ren等[31]對75例未發(fā)生LC的ACLF患者和328例CHB患者進(jìn)行比較后分析發(fā)現(xiàn)：①ACLF組患者出現(xiàn)前C和BCP區(qū)變異率明顯高于CHB患者；②HBV B基因型比C型更易發(fā)生ACLF；③當(dāng)前C/BCP區(qū)出現(xiàn)單變異T1753V（C/A/G）,A1762T,G1762A,G1896,G1899A和三聯(lián)變異A1762T/G1764A/C1766T、T1753V/A1762T/G1764A時(shí)，提示HBV B基因型與以上前C/BCP區(qū)的變異位點(diǎn)是預(yù)測ACLF發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

本課題組前期完成的研究結(jié)果表明，在793例乙肝患者中（包括325例CHB-M、170例CHB-S和298例ACLF患者），發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A與T1753V、C1766T和T1768A共存以及T1753V、C1766T、T1768A的三聯(lián)變異可顯著增加病毒復(fù)制力，這些前C/BCP區(qū)的聯(lián)合變異常出現(xiàn)在ACLF患者中，其發(fā)生率明顯高于CHB患者,進(jìn)一步證明在前C/BCP區(qū)發(fā)生的變異位點(diǎn)累積增多及多聯(lián)變異是增加ACLF發(fā)生率的新的危險(xiǎn)因素；此外，BCP區(qū)A1846T出現(xiàn)的變異，在ACLF患者中的發(fā)生率明顯高于CHB患者，推測A1846T變異可做為預(yù)測ACLF發(fā)生的另外一個(gè)重要指標(biāo)[32]。

Zhang[33]對87例ACLF患者（29例ACLF-CHB、58例ACLF-LC）、52例CHB患者、51例LC患者研究也同樣證明了，在CHB、LC、ACLF患者中，B基因型發(fā)生A1846T或C1913A/G變異時(shí)在ACLF患者中發(fā)生率較高；同時(shí)，多變量分析發(fā)現(xiàn)A1846T或C1913A/G變異是ACLF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

Xiao[34]對322例HBV患者（包括77例ACLF、109例HCC、136例CHB）進(jìn)行基因型分類及前C/BCP區(qū)變異相關(guān)分析，結(jié)果表明：B基因型為198/322（61.5%）、C基因型為124/322（38.5%）；A1762T/G1764A、A1846T和G1896A變異在ACLF患者中的發(fā)生率為（50.7%），在CHB患者中發(fā)生率為（28%），該研究同樣也證明了HBV患者伴有B基因型、A1762T/G1764A、A1846T和G1896A等前C/BCP區(qū)的變異與ACLF的發(fā)生顯著相關(guān)。

此外，Hu等[35]對前C/BCP區(qū)的變異與ACLF之間的關(guān)系進(jìn)行Meta分析研究，其共搜索了31篇關(guān)于報(bào)道ACLF相關(guān)的文章，其中對1995例ACLF和3822例CHB患者進(jìn)行比較，對前C/BCP區(qū)出現(xiàn)的變異位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)：T1753V、A1762T、G1764A、A1762T/G1764A、C1766T、T1768A、A1846T、G1896A、G1896A/A1762T/G1764A變異以及HBeAg陰性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其發(fā)生與ACLF顯著相關(guān)，推測前C/BCP區(qū)出現(xiàn)上述位點(diǎn)的變異是預(yù)測ACLF的發(fā)生和進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素。

5 小結(jié)

ACLF的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，由多因素共同參與，目前其具體致病機(jī)制還未完全清楚，但病毒變異和機(jī)體免疫病理損傷在HBV疾病轉(zhuǎn)歸中起重要的作用，即：HBV基因型、前C/CP區(qū)變異、HNF4α、免疫損傷機(jī)制與ACLF的發(fā)生和進(jìn)程顯著相關(guān)。當(dāng)HBV出現(xiàn)前C區(qū)變異后，可發(fā)生HBeAg陰性CHB；CP區(qū)出現(xiàn)變異后可使HBeAg表達(dá)降低，病毒復(fù)制力增強(qiáng)，從而易于引起機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)打破，在誘發(fā)因素和（或）宿主遺傳易感因素的共同作用下，可導(dǎo)致過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起嚴(yán)重的病理損傷，使細(xì)胞短期內(nèi)大量壞死，發(fā)展為ACLF。目前，對于ACLF的治療缺乏十分有效的治療方法，ACLF患者的病情發(fā)展迅速、并發(fā)癥較多、死亡率較高。

上述關(guān)于前C/CP區(qū)出現(xiàn)的重要病毒變異位點(diǎn)和機(jī)體免疫病理機(jī)制的研究有助于闡明ACLF的發(fā)生機(jī)制，并對臨床預(yù)警分析有積極意義。此外，臨床上應(yīng)該重視HBV患者出現(xiàn)前C/CP區(qū)變異的病情變化，及早做出正確的干預(yù)和對癥治療，有效地降低ACLF患者的死亡率。

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（收稿：2015-07-28）

（本文編輯：朱傳龍）

Precore and core promoter mutations of hepatitis B virus and their roles in acute-on-chronic liver failure

Huang Pengyu，Xu
Dongping.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，School of Laboratory Medicine，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，Guangdong Province，China

Acute-on-chronic liver failure（ACLF）is common type of liver failure，with poor prognosis and high mortality.Hepatitis B virus（HBV）infection is the major cause of ACLF in China.HBV precore/core promoter（PC/CP）region gene mutation is closely related to the occurrence of ACLF.In this article，we reviewed the structure and functions，biological change by mutations of HBV precore/core promoter，and immunopathogenetic mechanisms of ACLF.

Acute-on-chronic liver failure；Hepatitis B virus；Precore region；Core promoter；Mutation

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.035

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81271847）

524000 廣東省湛江市廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所（黃鵬宇）；解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心（徐東平）

黃鵬宇，男，25歲，碩士研究生。主要從事乙型肝炎病毒變異的檢測與臨床意義研究

徐東平，E-mail:xudongping302@sina.com