動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

洪云鶴,李偉青,林　中,3,張　元,張經(jīng)華,劉　艷,張寶善,張　峰,*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119;3.莆田出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建莆田 351100;4.北京市理化分析測(cè)試中心,北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心,北京 100089)

?

動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

洪云鶴1,2,李偉青1,林中1,3,張?jiān)?,張經(jīng)華4,劉艷4,張寶善2,張峰1,*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119;3.莆田出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建莆田 351100;4.北京市理化分析測(cè)試中心,北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心,北京 100089)

由動(dòng)物養(yǎng)殖過程中抗生素濫用而引發(fā)的食品安全問題已經(jīng)引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。當(dāng)前已有5代近60種頭孢菌素類抗生素被應(yīng)用于人用藥和獸藥領(lǐng)域,為全面了解動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)現(xiàn)狀,本文總結(jié)了動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用情況,詳細(xì)介紹了樣品前處理及檢測(cè)方法研究進(jìn)展,并對(duì)食品中該類抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展前景予以展望。

頭孢菌素,動(dòng)物源性食品,檢測(cè),藥物殘留

頭孢菌素(Cephalosporins)類抗生素是一類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的廣譜半合成抗生素。意大利微生物學(xué)家Brotzu[1]于上世紀(jì)50年代在城市下水道入?？诘暮Ｋ邪l(fā)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌和傷寒桿菌有抗菌作用的霉菌,并鑒定為頭孢菌屬(Cephalosporiumacremonium)。研究學(xué)者從其發(fā)酵液中先后分離出了七種具有抗菌作用的物質(zhì),統(tǒng)稱為頭孢菌素[2]。發(fā)展至今已有5代近60種該類抗生素被成功研制出來,對(duì)于革蘭氏陽性菌、陰性菌及螺旋體均顯示廣譜抗菌活性。頭孢菌素具有殺菌力強(qiáng)、毒副作用小、過敏反應(yīng)少、且對(duì)于酸和β-內(nèi)酰胺酶比青霉素穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床和獸藥領(lǐng)域[3]。然而,頭孢菌素的不規(guī)范使用會(huì)導(dǎo)致在動(dòng)物體內(nèi)殘留蓄積,長(zhǎng)期食用含該類藥物殘留的動(dòng)物源性食品會(huì)增加人類感染抗藥性細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn),且對(duì)于對(duì)該類抗生素有過敏反應(yīng)的人群而言存在極大的健康威脅。出于這些不利因素的考慮,歐盟、美國(guó)、日本等都對(duì)于奶類、肉類和動(dòng)物內(nèi)臟中頭孢菌素殘留制定了限量標(biāo)準(zhǔn),我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定牛奶中頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢噻呋等該類藥物最高殘留限量(MRL)4～100 μg/kg,肌肉、肝臟、腎臟中限量為50～1000 μg/kg[4]。隨著人們對(duì)食品安全問題的重視,各國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)也更加嚴(yán)格。因此,對(duì)于頭孢菌素類抗生素檢測(cè)技術(shù)的研究尤為重要。

當(dāng)前對(duì)于動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留的檢測(cè)主要集中在奶類、蛋類、肉類、魚等水產(chǎn)品中,為滿足動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留相關(guān)研究需要,近年來各國(guó)技術(shù)人員在該領(lǐng)域的研究都取得了較大的進(jìn)展,開發(fā)出微生物分析法、免疫分析法(IAS)、液相色譜法(LC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、毛細(xì)管電泳法等多種該類抗生素檢測(cè)技術(shù),研究論文報(bào)道日益增多,為該類獸藥的合理使用、動(dòng)物源性食品的質(zhì)量安全等提供了一定的技術(shù)支持。但目前還少有頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)相關(guān)綜述報(bào)道,本文針對(duì)當(dāng)前動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留研究現(xiàn)狀及其檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述,以期為該領(lǐng)域的研究和監(jiān)控提供依據(jù)和參考。

1　 樣品分析前處理技術(shù)

動(dòng)物源性食品普遍含有較高的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、無機(jī)鹽、維生素等組分,這就要求在前處理階段盡可能多地提取待測(cè)物質(zhì)同時(shí),排除這些內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,降低檢測(cè)限[5]。目前用于動(dòng)物源性食品頭孢菌素殘留檢測(cè)的前處理方法主要有液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)、磁性固相萃取(MSPE)及QuEChERS法等[5-7]。

1.1 液-液萃取(LLE)

液-液萃取是利用兩種不相溶的液相之間物化性質(zhì)的差異來進(jìn)行物質(zhì)的差別分配,從而使溶劑從一相轉(zhuǎn)移到另一相[8],也可以通過對(duì)pH的調(diào)節(jié)改變物質(zhì)在兩相中的分配,具有分離效率高,容易操作等優(yōu)勢(shì),但同時(shí)也存在方法繁瑣、選擇性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)廢液多的缺點(diǎn)。Marilena E.Dasenaki等[9]應(yīng)用液-液萃取前處理方法,建立了牛奶和魚類中包括頭孢匹林、頭孢克洛等頭孢菌素類藥物在內(nèi)的143種藥物殘留的Q-TOF(四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜)篩查方法,向樣品中加入含0.1%甲酸和0.1% EDTA(乙二胺四乙酸)的水、甲醇及乙腈,渦旋混勻使用超聲提取,離心后上清液放于-20 ℃ 12 h以除去蛋白質(zhì)和部分脂質(zhì),最后加入正己烷脫脂完成凈化。Joseph M.Storeya[10]等建立了水產(chǎn)品中七類抗生素殘留的LC-MS/MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)檢測(cè)技術(shù),樣品中加入EDTA-Mcllvaine(乙二胺四乙酸-磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液)后,使用乙腈、對(duì)氨基苯磺酸、氯化鈉等作為提取劑,振搖提取,取有機(jī)層檢測(cè),得到88%～118%的回收率,檢出限0.073～0.915 μg/kg。

近年來,還有學(xué)者將傳統(tǒng)液-液萃取技術(shù)與固相萃取技術(shù)相結(jié)合,于樣品SPE上柱前先使用LLE對(duì)復(fù)雜樣品基質(zhì)進(jìn)行初步凈化提取,再使用SPE的高選擇性對(duì)樣品進(jìn)一步富集凈化,有效地減弱具有復(fù)雜成分樣品中的基質(zhì)效應(yīng)[11]。但液-液萃取技術(shù)普遍存在試劑消耗量大、凈化溶液組成復(fù)雜、操作費(fèi)時(shí)等缺陷,在動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)中已經(jīng)逐步被其他前處理方法所取代。

1.2固相萃取

較為常見的SPE固相萃取技術(shù)是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附,與樣品中的干擾化合物分離然后再用洗脫液洗脫,從而達(dá)到分離富集目標(biāo)化合物的目的[12]。在動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測(cè)過程中,常將固相萃取作為色譜、質(zhì)譜等檢測(cè)手段的前處理技術(shù)以減少樣品中的基質(zhì)效應(yīng),因其操作簡(jiǎn)單、方便快捷、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),在現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)中被廣泛使用。Noemí Dorival-García等[13]建立了牛奶中38種抗生素殘留的檢測(cè)技術(shù),樣品加水和乙腈提取,氮吹后加入PBS溶液(磷酸鹽緩沖液),采用HLB固相萃取柱凈化樣品,以1∶1的乙腈-水溶液洗脫,經(jīng)UPLC-MS/MS(超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)檢測(cè),該法回收率為68%～118%,定量限0.03～10 μg/kg。

美國(guó)的Barker教授[14]于1989年在SPE前處理技術(shù)基礎(chǔ)上提出了一種快速樣品前處理技術(shù),即基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)。該法將待測(cè)樣品與適量分散劑即吸附劑混合研磨均勻,轉(zhuǎn)移至層析柱中,采用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行洗脫,分散劑加大了洗脫溶劑與待測(cè)樣品的接觸面積,從而達(dá)到了快速分離溶解待測(cè)物質(zhì)的目的。Eftichia G等[15]建立了超聲輔助基質(zhì)固相分散萃取的HPLC-DAD檢測(cè)技術(shù),對(duì)于牛奶中8種頭孢菌素類抗生素做以篩查,使用Nexus材料作為吸附劑,方法精密度(RSD)均低于15.3%,樣品檢測(cè)中8種頭孢菌素回收率穩(wěn)定在93.8%～115.3%之間,LOQ為5.0～48.3 μg/kg。

磁性固相萃取是近幾年發(fā)展起來的一種用于復(fù)雜基質(zhì)中分離痕量目標(biāo)物的熱點(diǎn)技術(shù),目前已經(jīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。該法是在處理過的磁鐵礦等磁性顆粒表面,修飾上用于吸附待測(cè)物質(zhì)的官能團(tuán)材料,以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的富集凈化,具有操作簡(jiǎn)單、萃取時(shí)間短、有機(jī)溶劑用量少、分離速度快等優(yōu)勢(shì),較之其他樣品前處理技術(shù)手段更高效快捷,具有良好的發(fā)展?jié)摿?。Xiaodan Liu等[16]將C-18 Fe3O4@mSiO2磁性微球(C18修飾的磁芯孔殼微球)用于牛奶中頭孢菌素的檢測(cè)前處理,樣品中加入微球吸附待測(cè)物質(zhì)(3種頭孢類抗生素),再裝柱凈化洗脫,采用LC-MS/MS法分離檢測(cè),方法回收率85%～115%,精密度(RSD)6.3%～10.8%。

固相萃取技術(shù)因其選擇性高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、凈化效果好等優(yōu)勢(shì),成為動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留分析時(shí)的首選前處理技術(shù)。

1.3QuEChERS法

所謂QuEChERS法即快速(Quick)、簡(jiǎn)易(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、穩(wěn)定(Rugged)、安全(Safe)的前處理方法。一般來說是采用乙腈或醋酸乙腈為提取劑,以氯化鈉和無水硫酸鎂等鹽類為吸水劑,PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)去除糖和脂肪、色素等雜質(zhì)干擾[17]。該法也因其獨(dú)特的性能和快速、簡(jiǎn)易、費(fèi)用低廉、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)在殘留分析中被廣泛應(yīng)用。

近年來研究學(xué)者又在原方法基礎(chǔ)上做以改進(jìn)開發(fā)出適用于多種獸藥殘留檢測(cè)的QuEChERS法。為頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)的QuEChERS凈化技術(shù)提供了充足的先行條件。George Stubbings[18]開發(fā)出使用QuEChERS技術(shù)檢測(cè)肌肉組織中多種獸藥殘留的LC-MS/MS法,取樣品勻漿5 g加入1%乙腈-乙酸溶液(V:V)15 mL溶解,添加5 g無水硫酸鈉渦旋混勻,離心取上清液添加Bondesil NH2吸附劑15 min后離心,取上清液3 mL氮吹濃縮再采用1∶1的乙腈-水溶液復(fù)溶,該法平均回收率為79.8%,檢出限可達(dá)3 μg/kg。卜明楠等[19]建立了蝦肉中72種獸藥殘留的QuEChERS 結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定的分析方法,使用5%的醋酸乙腈溶液作為提取劑,配合無水硫酸鈉和氯化鈉均質(zhì)提取離心,上清液添加C18分散劑,乙腈為提取劑,氮吹濃縮,1%甲酸-乙腈(4∶1)溶液定容,方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

由于頭孢菌素類藥物側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,檢測(cè)技術(shù)開發(fā)較為困難,在現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)出的動(dòng)物源性食品中藥物殘留QuEChERS前處理方法中,只涉及很少一部分該類藥物殘留檢測(cè)技術(shù);但QuEChERS技術(shù)具有機(jī)試劑消耗量少,環(huán)境污染小,操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì),在動(dòng)物源性食品中頭孢類藥物殘留檢測(cè)前處理技術(shù)的應(yīng)用上具有很大的發(fā)展空間。

1.4其它樣品前處理方法

除上述樣品前處理方法外,近年來還有學(xué)者逐步將超臨界流體萃取、微波萃取、分子印跡等技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的檢測(cè)方面[20-22]。

但在現(xiàn)有技術(shù)水平下,超臨界流體萃取(SFE)對(duì)于部分食品基質(zhì)中抗生素萃取率相對(duì)偏低,選擇性不高;分子印跡技術(shù)操作復(fù)雜,對(duì)環(huán)境要求高;微波萃取存在萃取溶劑揮發(fā)、可能改變部分待測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)等目前尚未得到解決的不利因素,在動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域尚未得到廣泛使用。

2　檢測(cè)方法

目前來說,應(yīng)用于食品中頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)方法大致可分為微生物分析法、免疫分析法和儀器分析法三類。

2.1微生物分析法

微生物檢測(cè)法主要是根據(jù)抗生素對(duì)特異微生物的生理機(jī)能、繁殖代謝的抑制作用,對(duì)抗生素殘留進(jìn)行定性、定量檢測(cè),以此來確定基質(zhì)中該類抗生素殘留量。李延華等[23]應(yīng)用常見的BSDA法(嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法)、TTC法[24](氯化三苯基四氮唑法)和試管擴(kuò)散法三種微生物檢測(cè)法對(duì)牛奶中包括頭孢吡林在內(nèi)的6種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)。以歐盟法典中最大殘留限量為標(biāo)準(zhǔn),其中BSDA法檢測(cè)限可達(dá)0.50倍MRLs,但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),操作繁瑣;TTC法對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的6種抗生素檢測(cè)限為2～6倍的最大殘留限量,不符合標(biāo)準(zhǔn);而試管擴(kuò)散法檢測(cè)限為0.5～1.5倍MRLs,且較之其他兩種檢測(cè)法在檢測(cè)時(shí)間和操作難易程度上而言具有一定的優(yōu)越性。

但食品基質(zhì)組分復(fù)雜,微生物檢測(cè)法在實(shí)際應(yīng)用中,特異性不強(qiáng),易受到其他具備抑菌作用的抗生素殘留及其他物質(zhì)干擾,出現(xiàn)假陽性結(jié)果,因此很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化定量檢測(cè)。

2.2免疫分析法(IAS)

免疫分析法是以抗原抗體識(shí)別為核心反應(yīng)的分析方法,具有單獨(dú)任何一種理化分析技術(shù)難以達(dá)到的選擇性和靈敏度,適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分離檢測(cè),但其中抗體制備技術(shù)復(fù)雜且不容易實(shí)現(xiàn)高通量,目前用于藥物殘留分析的免疫分析法主要包括放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[25]。

放射免疫檢測(cè)法在抗生素類殘留分析檢測(cè)中的應(yīng)用包含CHARMⅠ和CHARMⅡ法[26],其中CHARMⅠ是專用于牛奶中頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法,而CHARMⅡ法還可用于其他食品基質(zhì)中多種抗生素殘留的快速檢測(cè)[27]。中國(guó)采用CHARMⅡ試劑盒制定了相關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn),用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中包括頭孢菌素在內(nèi)的多種抗生素殘留。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)[28]是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使得酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行,酶與底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)即可用于待測(cè)物質(zhì)定量測(cè)定。姜侃等[29]應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法建立了乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的快速檢測(cè)方法,方法特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)限達(dá)1.1～2.4 μg/L。

酶標(biāo)記受體分析法(ELR)的應(yīng)用上,李鐵柱[30]建立了酶標(biāo)受體方法檢測(cè)牛奶中的頭孢噻呋和青霉素G,檢測(cè)限可達(dá)20 μg/kg。美國(guó)IDEXX公司[31]以免疫受體為原理研發(fā)了Parallux實(shí)驗(yàn)室儀器,實(shí)現(xiàn)了使用該法檢測(cè)多種抗生素及其他干擾發(fā)酵的物質(zhì),已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于頭孢類殘留的檢測(cè)。

應(yīng)用于抗生素殘留檢測(cè)方面的免疫分析法還包括膠體金免疫層析法[32],王學(xué)力等[33]建立了同步檢測(cè)頭孢菌素類抗生素與鏈霉素膠體金免疫層析法,在不同基質(zhì)中對(duì)于頭孢氨芐、頭孢拉定的最低檢測(cè)限為20～100 ng/mL。此外,還有熒光免疫分析法、免疫親和層析等技術(shù)應(yīng)用于抗生素的檢測(cè)中。

2.3儀器分析法

近年來,儀器分析技術(shù)以其方便、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)在動(dòng)物源性食品抗生素殘留檢測(cè)方面被廣泛應(yīng)用,具有高靈敏度、低檢測(cè)限、低定量限、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)[34]。目前已經(jīng)被開發(fā)的頭孢菌素類獸藥殘留儀器分析檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、超高效液相色譜法(UPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)等。

2.3.1液相色譜法(HPLC)液相色譜法是最早用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中頭孢菌素殘留的方法之一,具有分離效率高、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),在食品分析領(lǐng)域備受關(guān)注。食品基質(zhì)組分較為復(fù)雜,色譜技術(shù)的應(yīng)用可以通過對(duì)流動(dòng)相和固定向的選擇,將復(fù)雜組分中的待測(cè)物質(zhì)和干擾成分加以分離,并采用光譜或質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分析鑒定。

傳統(tǒng)HPLC技術(shù)常配置紫外或熒光等光學(xué)檢測(cè)器,頭孢菌素類抗生素?fù)碛辛己玫淖贤馕?因此在食品中該類抗生素殘留的分析中常使用DAD檢測(cè)器。Lambert K.S?rensen等[35]人使用該技術(shù)建立了牛奶中4中頭孢菌素類殘留的檢測(cè)方法,樣品離心脫脂,乙腈沉淀蛋白后取上清液氮吹濃縮至2 mL,加水定容到20 mL,使用tC18 SPE固相萃取柱凈化樣品,設(shè)置甲醇-乙腈水溶液梯度洗脫程序,四種頭孢菌素類抗生素檢測(cè)限7～11 μg/kg,在20～200 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性和回收率良好。

超高效液相色譜(UPLC)是在HPLC系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)出的使色譜分離解析度更高層次的一種分離檢測(cè)技術(shù),與傳統(tǒng)HPLC技術(shù)相比,UPLC具有更小的延遲體積和更高的檢測(cè)器靈敏度,因此其可在最短的時(shí)間里,使樣品得到最有效的分離。Lian Wang等[36]使用UPLC-DAD在268 nm波長(zhǎng)下建立了快速篩查牛奶中頭孢哌酮等十種抗生素殘留檢測(cè)技術(shù),檢出限0.003～0.022 μg/g,定量限0.01～0.08 μg/g。劉浩等[37]利用UPLC技術(shù)對(duì)于頭孢噻吩鈉中的3-位置異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè),采用苯己基三鍵鍵合亞乙基橋雜化顆粒柱,以0.05 mol/L甲酸銨緩沖液-乙腈-甲醇(85∶9∶6)為流動(dòng)相對(duì)原料進(jìn)行分離,254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),檢出限0.064μg/mL,定量限為0.214μg/mL。

2.3.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)LC分析法中,光學(xué)檢測(cè)器無法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析鑒定,LC-MS技術(shù)集合液相色譜的高分離效率和質(zhì)譜檢測(cè)器的高靈敏度,近年來逐漸成為動(dòng)物源性食品抗生素殘留的檢測(cè)領(lǐng)域使用最廣泛的技術(shù)之一。在頭孢菌素的鑒定方面,Xiaodan Liu等[38]使用親水相互作用色譜柱,應(yīng)用LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)成功對(duì)牛奶中的其中頭孢類抗生素殘留進(jìn)行了分離鑒定,對(duì)比傳統(tǒng)反相HILIC親水柱,其分析速度和分離效率都有明顯提高,線性范圍內(nèi)R2大于0.999,樣品檢測(cè)平均回收率100.57%,方法檢測(cè)限(LOD)0.44 μg/mL,定量限1.47 μg/mL。我國(guó)也已經(jīng)有牛奶和奶粉中部分頭孢菌素類抗生素殘留檢測(cè)的LC-MS/MS技術(shù)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[39]。

UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)集合了UPLC分離時(shí)間短、效率高和質(zhì)譜檢測(cè)器高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢(shì),成為抗生素檢測(cè)領(lǐng)域十分具有發(fā)展前景的分析技術(shù)[40]。研究學(xué)者[41]應(yīng)用該技術(shù)建立了頭孢呋辛的快速定量檢測(cè)技術(shù),在0.5 mL/min流速下,對(duì)于該物質(zhì)的分析時(shí)間僅為1 min,定量限為0.1 μg/mL,回收率水平良好為99.94%～100.47%,樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差穩(wěn)定在2%以內(nèi)。但該技術(shù)也存在儀器配件耗材費(fèi)用較高,需要配備獨(dú)立色譜柱等局限性,且已經(jīng)被開發(fā)出的檢測(cè)方法相對(duì)于HPLC等技術(shù)還較少,殘留檢測(cè)時(shí)往往需要對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行摸索開發(fā)。

除較為普及的三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器外,Q-TOF[9]和Q-Exactive(四級(jí)桿-軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜)[42]等高分辨率質(zhì)譜檢測(cè)器和液相色譜技術(shù)的聯(lián)用也為動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留的檢測(cè)篩查提供了較為可靠的技術(shù)支持。

2.3.3毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳(CE)又稱高效毛細(xì)管電泳,它是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的高效分離技術(shù),具有儀器簡(jiǎn)單、分析速度快、樣品和試劑耗用量少、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等特點(diǎn),左艷麗[43]將毛細(xì)管電泳法應(yīng)用于頭孢菌素等抗生素藥物的檢測(cè)中,建立了毛細(xì)管帶電泳法同時(shí)測(cè)定頭孢曲松鈉和左氧氟沙星含量的檢測(cè)方法,其中對(duì)于頭孢曲松鈉的檢測(cè)達(dá)到了2.5 μg/mL的檢出限和8.3 μg/mL的定量限,在10～500 μg/mL范圍內(nèi)線性范圍良好R2>0.999,平均回收率99.15%。

近年來該法被研究學(xué)者應(yīng)用于食品領(lǐng)域中[44],開發(fā)出一系列殘留檢測(cè)技術(shù)。紫外檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器是在毛細(xì)管電泳技術(shù)中最常用的兩種檢測(cè)器,近年來還有CE與質(zhì)譜檢測(cè)器相連進(jìn)行生物化學(xué)等物質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道[45]。但由于該法使用的毛細(xì)管直徑小,導(dǎo)致光路變短、靈敏度偏低,分離重現(xiàn)性較HPLC技術(shù)相對(duì)欠缺,在食品中抗生素殘留檢測(cè)領(lǐng)域也同時(shí)存在一定的局限性。

3　結(jié)語

在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中,抗生素濫用問題頻發(fā),當(dāng)前對(duì)于獸藥殘留的研究趨勢(shì)是通過儀器分析建立高通量的篩查手段,對(duì)食品中獸藥、農(nóng)藥殘留做以全面監(jiān)控。但在現(xiàn)階段技術(shù)水平支持下,高通量篩查除過分析儀器維護(hù)、檢測(cè)費(fèi)用高之外,也同樣存在由于通量過大而引發(fā)的方法專屬性不高、部分獸藥、農(nóng)藥定量不夠準(zhǔn)確等問題。在高通量的前提下,開發(fā)出專屬性好、檢測(cè)成本低、快速高效、更為精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)是食品安全領(lǐng)域亟待解決的問題,就目前的發(fā)展趨勢(shì)來看,動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)方式還具有相當(dāng)大的發(fā)展空間。

3.1檢測(cè)方法多樣化

我國(guó)動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素殘留的檢測(cè)相關(guān)研究與其他種類獸藥殘留的研究相比仍顯不足,有關(guān)食品中該類抗生素殘留的檢測(cè)分析方法還不夠成熟。就目前的研究趨勢(shì)來看,除了完善免疫分析快速檢測(cè)技術(shù)、研發(fā)更為先進(jìn)且專屬性強(qiáng)、靈敏度高的快速檢測(cè)產(chǎn)品外,分析方法多樣化亦是當(dāng)今殘留分析相關(guān)研究的熱點(diǎn)。

SELEX即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù),適配體作為一種前沿生物材料在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有重要作用[46]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)有學(xué)者將適配體技術(shù)成功應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域[47],相比傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)而言,核酸適配體分子小、無免疫原性的特征在抗體的制備上體現(xiàn)了極大的優(yōu)勢(shì),且該技術(shù)特異性高、可識(shí)別結(jié)構(gòu)十分類似的物質(zhì)并實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。應(yīng)用方面,研究人員[48]在ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)上,成功使用酶聯(lián)適配體建立了蜂蜜中四環(huán)素等抗生素的檢測(cè)技術(shù)。

原位檢測(cè)技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的成功應(yīng)用解決了常用食品檢測(cè)方法分析時(shí)間長(zhǎng)、前處理步驟繁瑣等問題[49],近年來主要應(yīng)用于初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留[50]及非法添加劑[49]等物質(zhì)的檢測(cè)中。

3.2檢測(cè)儀器微型化

“現(xiàn)場(chǎng)、快速、便攜式”一直以來都是國(guó)內(nèi)外分析儀設(shè)備研究關(guān)注的重點(diǎn)。便攜式質(zhì)譜儀的研發(fā)[51]與應(yīng)用成功將真空泵最小化,檢測(cè)特異性和靈敏度大大增強(qiáng),儀器信噪比可提升為傳統(tǒng)方式的2～10倍,該技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于農(nóng)藥殘留和化妝品的檢測(cè)中,實(shí)現(xiàn)了小型質(zhì)譜儀與原位采樣技術(shù)相結(jié)合。針對(duì)第二代質(zhì)譜儀掃描速度較慢的缺陷,現(xiàn)已經(jīng)研發(fā)出將掃面速度大幅提升的第三代質(zhì)譜儀,平均為0.1～0.2 s掃描一次。

相信隨著新技術(shù)的不斷應(yīng)用優(yōu)化,定會(huì)在現(xiàn)有水平上攻克更多難題、取得較大突破,為食品安全監(jiān)控及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。

[1]Brotzu G. Lavori Inst[J].Igiene Univ. Cagliari,I948-54,1948.

[2]Burton H S,Abraham E P. Isolation of antibiotics from a species of Cephalosporium. Cephalosporins P1,P2,P3,P4 and P5[J].Biochemical Journal,1951,50(2):168.

[3]薛雨,陳宇瑛.頭孢菌素類抗生素的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志,2011,36(2):86-92.

[4]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第253號(hào)公告,動(dòng)物食品中獸藥最高殘留限量[S].2002.

[5]劉世娟. HPLC-MS/MS 檢測(cè)肌肉組織中多頭孢菌素殘留方法的建立[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[6]錢琛,李靜,陳桂良. 動(dòng)物源性食品獸藥殘留分析中樣品前處理方法的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,5:026.

[7]王偉. LC-MS/MS 測(cè)定蜂蜜中獸藥多殘留[D].保定：河北大學(xué),2013.

[8]于品華,常志東,金聲超,等.液-液萃取及新型液-液-液三相萃取機(jī)理研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2009,28(9):1507-1512.

[9]Dasenaki M E,Bletsou A A,Koulis G A,et al. Qualitative Multiresidue Screening Method for 143 Veterinary Drugs and Pharmaceuticals in Milk and Fish Tissue Using Liquid Chromatography Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2015,63(18):4493-4508.

[10]Storey J M,Clark S B,Johnson A S,et al. Analysis of sulfonamides,trimethoprim,fluoroquinolones,quinolones,triphenylmethane dyes and methyltestosterone in fish and shrimp using liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B,2014,972:38-47.

[11]于潔. 獸用抗微生物藥物殘留質(zhì)譜篩選方法研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[12]高巍,武中平,徐春祥,等.固相萃取技術(shù)研究[J].江蘇食品與發(fā)酵,2006,3:004.

[13]Dorival-García N,Junza A,Zafra-Gómez A,et al. Simultaneous determination of quinolone andβ-lactam residues in raw c ow milk samples using ultrasound-assisted extraction and dispersive-SPE prior to UHPLC-MS/MS analysis[J]. Food Control,2016,60:382-393.

[14]Barker S A,Long A R,Short C R. Isolation of drug residues from tissues by solid phase dispersion[J]. Journal of Chromatography A,1989,475(2):353-361.

[15]Karageorgou E G,Samanidou V F. Application of ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersion extraction to the HPLC confirmatory determination of cephalosporin residues in milk[J].Journal of separation science,2010,33:2862-2871.

[16]Liu X,Yu Y,Zhao M,et al. Solid phase extraction using magnetic core mesoporous shell microspheres with C18-modified interior pore-walls for residue analysis of cephalosporins in milk by LC-MS/MS[J].Food chemistry,2014,150:206-212.

[17]李春艷. QuEChERS法一色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)應(yīng)用中的研究[D].西安：西安理工大學(xué),2010.

[18]Stubbings G,Bigwood T. The development and validation of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)procedure for the determination of veterinary drug residues in animal tissue using a QuEChERS(QUick,Easy,CHeap,Effective,Rugged and Safe)approach[J]. Analytica Chimica Acta,2009,637(1):68-78.

[19]卜明楠,石志紅,康健,等. QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定蝦肉中72種獸藥殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012,05:552-558.

[20]陳淑蓮,游靜,王國(guó)俊.超臨界流體萃取在食品分析中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2000,01:37-39.

[21]張軼群.動(dòng)態(tài)微波輔助萃取在食品和中藥分析中的應(yīng)用研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2014.

[22]安奉凱,潘紅青,賈曉川,等.分子印跡技術(shù)在食品安全檢測(cè)分析中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2009,3:154-157.

[23]李延華,王偉軍,張?zhí)m威,等.微生物法檢測(cè)牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的對(duì)比研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2009,01:63-64.

[24]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留量檢驗(yàn).GB/T4789.27-2003[S].

[25]謝會(huì)玲.牛奶中頭孢類抗生素的免疫層析試紙條和ELISA試劑盒檢測(cè)方法研究[D].無錫：江南大學(xué),2009.

[26]Korsrud G O,Papich M G,Fesser A C E,et al. Laboratory testing of the Charm Test II receptor assays and the Charm farm test with tissues and fluids from hogs fed sulfamethazine,chlortetracycline,and penicillin G[J]. Journal of Food Protection?,1996,59(2):161-166.

[27]Kwon S I,Owens G,Ok Y S,et al. Applicability of the Charm II system for monitoring antibiotic residues in manure-based composts[J]. Waste management,2011,31(1)::39-44.

[28]張琦,葉能勝,谷學(xué)新,等.β-內(nèi)酰胺類抗生素分析檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化學(xué)通報(bào)：印刷版,2009,05:394-400.

[29]姜侃,陳宇鵬,金燕飛,等.應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010,01:51-54.

[30]李鐵柱,孫永海,郗偉東.受體分析結(jié)合酶聯(lián)免疫檢測(cè)牛乳中的頭孢噻呋殘留[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2008,3(3):473-476.

[31]Huth S P,Warholic P S,Devou J M,et al. Parallux beta-lactam:a capillary-based fluorescent immunoassay for the determination of penicillin-G,ampicillin,amoxicillin,cloxacillin,cephapirin,and ceftiofur in bovine milk.[J]. Journal of Aoac International,2002,85(2):355-364.

[32]孫志文,陶光燦,羅曉琴,等.膠體金免疫層析法測(cè)定牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素和三聚氰胺殘留[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2012,03:39-42.

[33]王學(xué)立.同步檢測(cè)頭孢類抗生素與鏈霉素膠體金免疫層析法的建立[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[34]郭浩,王燕飛,鄒明強(qiáng),等.農(nóng)獸藥多殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,01:50-55.

[35]S?rensen L K,Snor L K. Determination of cephalosporins in raw bovine milk by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A,2000,882(1-2):145-151.

[36]Lian W,Li Y Q.Simultaneous Determination of Ten Antibiotic Residues in Milk by UPLC[J].Chromatographia,2009,70(1-2):253-258.

[37]劉浩,秦峰,趙敬丹,等. MEKC和UPLC檢測(cè)頭孢噻吩鈉中的3-位置異構(gòu)體雜質(zhì)[J].中國(guó)抗生素雜志,2015,7:516-520.

[38]Liu Q,Xu L,Ke Y,et al.Analysis of cephalosporins by hydrophilic interaction chromatography[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2011,54(3):623-628.

[39]GB/T 22989-2008,牛奶和奶粉中頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].2008.

[40]金明.UPLC-MS/MS測(cè)定牛肝中七種磺胺類藥物的研究[D].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[41]Siddiqui M R,Wabaidur S M,Alothman Z A,et al.Quantitative Assessment of Cefuroxime:A Second Generation Cephalosporin in Pharmaceutical Formulations and Spiked Plasma Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Asian Journal of Chemistry,2014.

[42]Wei J,Chu X,Yun L,et al.High-throughput screening of pesticide and veterinary drug residues in baby food by liquid chromatography coupled to quadrupole Orbitrap mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2014,1347(15):122-128.

[43]左艷麗.毛細(xì)管電泳法應(yīng)用于頭孢菌素類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素藥物的檢測(cè)[D].保定：河北大學(xué),2012.

[44]Zhu J P,Zhang H W,Hu C Q. Optimal mode of capillary electrophoresis for the impurity analysis ofβ-lactam antibiotics[J]. 中國(guó)藥學(xué)(英文版),2010.

[45]張政祥,薄濤,米健秋,等. 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用中的若干關(guān)鍵技術(shù)問題及解決方案[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2011,5:45-47.

[46]詹少兵,曾毅. SELEX技術(shù)及近年研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào),2013,05.

[47]Yiyang D,Yan X,Wei Y,et al.Aptamer and Its Potential Applications for Food Safety[J].Critical Reviews in Food Science & Nutrition,2014,54(12):1548-1561.

[48]Wang S,Liu J,Wei Y,et al. A direct competitive assay-based aptasensor for sensitive determination of tetracycline residue in Honey[J].Talanta,2015,131:562-569.

[49]張宗綿,劉睿,徐敦明,等.Au@ SiO 2 核殼結(jié)構(gòu)-表面增強(qiáng)拉曼光譜原位檢測(cè)食品中的酸性橙II[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2012,70(16):1686-1689.

[50]Li J F,Huang Y F,Ding Y,et al.Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J].nature,2010,464(7287):392-395.

[51]劉莉.我科學(xué)家研制出自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)便攜質(zhì)譜儀[J].分析儀器,2010,2(2):5-5.

Research development of detection methods of cephalosporins in food

HONG Yun-he1,2，LI Wei-qing1，LIN Zhong1,3，ZHANG Yuan1，ZHANG Jing-hua4，LIU Yan4,ZHANG Bao-shan2,ZHANG Feng1,*

(1.Chinese Academy of Ispection and Quarantine,Beijing 100176,China；2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China;3.Comprehensive Technical Service Center of Putian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Fujian Putian 351100,China;4.Beijing Center for Physical & Chemical Analysis,Beijing 100089,China)

Food safety problems caused by the abuse of antibiotics in animal breeding process has caused widespread concern in the community. There are nearly 60 kinds of cephalosporins have been used in clinical and veterinary fields. In order to fully understand the detection technology research status of the cephalosporin antibiotics,this paper summarizes the application of detection technology on cephalosporin antibiotic residues in food,foucusing on the sample preparation and detection methods and discussions of the trends of food cephalosporin antibiotic residues detection technology.

cephalosporins;animal derived food;detection;residues

2015-11-23

洪云鶴(1992-)，女，碩士在讀，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：hong_yunhe@163.com。

張峰(1974-)，男，博士，研究員，研究方向：分析化學(xué)，E-mail：fengzhang@126.com。

北京市科技計(jì)劃(Z141100002614020)；國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2012YQ14000806)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)13-0370-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.068