低氧對大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

李　敏，董子玉，陳學(xué)群

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低氧對大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

李敏，董子玉，陳學(xué)群

目的探討在低氧條件下SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表達(dá)，為闡明低氧腦水腫的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。方法將12只SD大鼠隨機(jī)分為常氧組和低氧組，低氧組大鼠在低氧艙中模擬高原海拔7 000 m低氧(7.8% O2)中暴露8 h，通過Western blot檢測大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)果在海拔7 000 m低氧暴露8 h后，SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。結(jié)論SD大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白在模擬高原海拔7 000 m低氧8 h后表達(dá)升高，提示HIF-1可能通過上調(diào)AQP4蛋白的表達(dá)參與了低氧腦水腫的發(fā)生。

低氧；腦水腫；水通道蛋白4；低氧誘導(dǎo)因子-1

人體的腦組織耗氧量大，對缺氧十分敏感，急性低氧可使腦組織水分異常過度集聚引起腦水腫。低氧腦水腫發(fā)生時腦體積增大、顱內(nèi)壓升高，發(fā)展十分迅速，是可導(dǎo)致死亡的危急病癥[1]，如高原低氧環(huán)境可誘發(fā)腦水腫[2]。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一類廣泛分布于機(jī)體不同組織器官中的特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜蛋白，其中水通道蛋白4(AQP4)主要分布于腦組織中，在生理和病理狀態(tài)下均參與細(xì)胞中水的轉(zhuǎn)運(yùn)，在腦組織水平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[3]。低氧條件下廣泛存在于各種人體細(xì)胞中的低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對機(jī)體低氧環(huán)境適應(yīng)和調(diào)控起關(guān)鍵作用。本文模擬急性高原低氧環(huán)境，研究低氧腦水腫時AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)變化，探討低氧暴露時腦組織的損傷，為闡明低氧腦水腫的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組雄性健康清潔級Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(170±15) g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為常氧對照組和7 000 m(7.8%O2)低氧組，每組各6只。

1.2主要試劑及儀器蛋白裂解液(RIPA)、BCA法測定蛋白試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，BSA(Biosharp，China)，蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific，USA)，兔源AQP4多克隆抗體(Merck Millipore，Germany)，小鼠源HIF-1α單克隆抗體(Novus Biologicals，USA)，內(nèi)參GAPDH單克隆抗體(上海康成生物公司)，其他常規(guī)溶液為國產(chǎn)分析純試劑配制；低氧艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)，臺式冷凍離心機(jī)(Heraeus Biofuge Stratos，USA)，0.45 μm PVDF膜(Merck Milipore,Germany)，蛋白電泳儀器和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad,USA)。

1.3低氧處理實(shí)驗(yàn)大鼠分為常氧對照組和低氧實(shí)驗(yàn)組。常氧對照組大鼠處于浙江省杭州市海拔100 m，含氧量20.9%，大氣壓為100.08 kPa。低氧實(shí)驗(yàn)組大鼠置于低氧艙(1 m3)中以250 m· min-1速度升至所需海拔高度7 000 m(7.8%O2)，暴露低氧8 h。對照組大鼠放置于另一形狀大小相同的低氧艙中，但不給予低氧。

1.4腦含水量測定在低氧結(jié)束后迅速將大鼠取出斷頭犧牲，并迅速分離取出全腦，稱量濕重，然后將其置于120 ℃烤箱內(nèi)，24 h烘至恒重后再稱量全腦干重。腦含水量計算公式為：[(濕重-干重)/濕重]×100%，按照該公式計算腦含水量百分比。

1.5蛋白提取低氧結(jié)束后大鼠出艙斷頭犧牲后，迅速取出大腦，用刀片取前額葉皮層約30 mg，置于配制好并且4 ℃預(yù)冷的裂解液中，然后勻漿提取蛋白。勻漿結(jié)束后，14 000 g 4 ℃離心20 min，取上清，分裝后于-20 ℃保存。1.6電泳和免疫印跡8% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳時采用3%濃縮膠80 V 30 min，8%分離膠120 V 100 min。200 mA轉(zhuǎn)膜2 h后，PVDF膜用TBST配制的5% BSA 37 ℃封閉2 h，然后再用PVDF膜分別和兔抗AQP4抗體(1∶2 000)、小鼠抗HIF-1α抗體(1∶500)和小鼠抗GAPDH抗體(1∶5 000)雜交，水平搖床4 ℃過夜(14～16 h)。TBST洗膜后PVDF膜再分別和相應(yīng)的辣根過氧化物酶二抗山羊抗兔(1∶2 000)和山羊抗小鼠(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，將膜至于ECL中曝光，顯影，定影。

1.7分析采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)軟件對Western blot 結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1低氧誘導(dǎo)大鼠腦水腫形成低氧8 h(模擬海拔7 000 m，7.8%O2)誘導(dǎo)大鼠腦含水量增加,常氧組為(76.46±0.42)%，低氧組為(78.01±0.57)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.1低氧誘導(dǎo)前額葉皮層AQP4蛋白表達(dá)增加與常氧對照組比較，低氧8 h(模擬海拔7 000 m，7.8%O2)大鼠前額葉皮層AQP4蛋白表達(dá)升高[常氧組：(58.86±6.14)%；低氧組：(101.02±16.87)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2低氧誘導(dǎo)前額葉皮層HIF-1α蛋白表達(dá)增加Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HIF-1α蛋白在大鼠前額葉皮層中有基礎(chǔ)表達(dá)，在低氧(模擬海拔7 000 m，即7.8%O2，8 h)處理后大鼠前額葉皮層中HIF-1α蛋白表達(dá)升高[常氧組：(11.20±2.75)%；低氧組：(20.04±3.78)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

低氧時HIF-1通過與低氧反應(yīng)相關(guān)基因的低氧反應(yīng)原件(hypoxia react factor，HRE)結(jié)合誘導(dǎo)下游靶基因，來介導(dǎo)低氧反應(yīng)，調(diào)控機(jī)體的無氧代謝，使細(xì)胞能夠耐受低氧狀態(tài)而存活下來[4]。HIF-1由α和β兩個亞基組成，其中HIF-1α受氧濃度調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF-1活性的功能亞單位，與機(jī)體的急性低氧反應(yīng)有關(guān)[5]。核磁共振結(jié)果顯示模擬高原海拔4 000 m低氧8 h即可以引起Wistar大鼠出現(xiàn)腦水腫，且隨著低氧程度加深，腦水腫也逐步加重[6]，SD大鼠在模擬高原海拔7 000 m低氧8 h后也出現(xiàn)腦水腫[7]。據(jù)報道，10 d新生大鼠頸動脈單側(cè)暫時性結(jié)扎24 h后梗死區(qū)形成腦水腫，免疫組化顯示梗死區(qū)域AQP4蛋白表達(dá)明顯上升[8]。AQP4參與腦組織的水調(diào)節(jié)，廣泛表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，在維持大腦的水平衡中起重要作用。在大鼠腦出血后的6 h，腦內(nèi)含水量和血腫周圍的AQP4蛋白表達(dá)增加，且AQP4蛋白表達(dá)量與腦內(nèi)含水量呈現(xiàn)正相關(guān)[9]。在水中毒腦水腫模型中，AQP4基因敲除小鼠腦組織含水量顯著減輕，生存能力增強(qiáng)，說明AQP4不僅參與了腦水腫的形成，并且起著重要的水調(diào)節(jié)作用[10]。本研究顯示，模擬高原海拔7 000 m低氧8 h促進(jìn)大鼠前額葉皮層AQP4蛋白表達(dá)明顯升高，說明AQP4表達(dá)增多在急性低氧腦水腫的形成過程中起重要作用。

HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，低氧時廣泛表達(dá)在腦、腎、肝和心臟等多種組織細(xì)胞中，是低氧狀態(tài)下細(xì)胞應(yīng)答的重要物質(zhì)。HIF-1α在常氧下半衰期<1 min，極易降解，但低氧下HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性都顯著增加[11]。同時低氧還可誘導(dǎo)HIF-1α蛋白集聚并且使HIF-1α與DNA結(jié)合的活性增加，激活下游的低氧相關(guān)靶基因[12]。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示全腦缺血可以誘導(dǎo)大鼠皮層、海馬HIF-1α蛋白表達(dá)增多[13]。Bernaudin發(fā)現(xiàn)新生大鼠在8%O2低氧3 h后腦內(nèi)HIF-1α表達(dá)顯著升高[14]。有研究證明利用RNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α蛋白產(chǎn)生則可以有效減少大鼠的缺血損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠模擬海拔7 000 m 8 h急性低氧后前額葉皮層HIF-1α蛋白表達(dá)與對照組相比顯著升高，這與前述結(jié)果一致，提示HIF-1α蛋白表達(dá)增多可能與急性低氧誘導(dǎo)的腦水腫有關(guān)。

綜上所述，模擬海拔7 000 m急性低氧8 h誘導(dǎo)大鼠前額葉皮層AQP4蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，提示AQP4蛋白和HIF-1α蛋白可能參與了急性低氧誘導(dǎo)的腦水腫，低氧條件下HIF-1可能通過對下游相關(guān)靶基因的調(diào)節(jié)上調(diào)AQP4蛋白的表達(dá)引起腦水腫。

[1]West JB.The physiologic basis of high-altitude diseases[J].Ann Intern Med,2004,141(10):789-800.

[2]Roach RC,Hackett PH.Frontiers of hypoxia research: acute mountain sickness[J].J Exp Biol,2001,204(18):3161-3170.

[3]Tait MJ,Saadoun S,Bell BA,et al.Water movements in the brain: role of aquaporins[J].Trends Neurosci,2008,31(1):37-43.

[4]Lee FS.Genetic causes of erythrocytosis and the oxygen-sensing pathway[J].Blood Rev,2008,22(6):321-332.

[5]Lee JW,Bae SH,Jeong JW,et al.Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions[J].Exp Mol Med,2004,36(1):1-12.

[6]杜寧,聶鴻靖,晉凌云,等.低氧致腦水腫的磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像和病理觀察[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2005,18(6):415-418.

[7]Chen SJ,Yang JF,Kong FP,et al.Overactivation of corticotropin-releasing factor receptor type 1 and aquaporin-4 by hypoxia induces cerebral edema[J].Proc Natl Acad Sci,2014,111(36): 13199-13204.

[8]Badaut J,Ashwal S,Tone B,et al.Temporal and regional evolution of aquaporin-4 expression and magnetic resonance imaging in a rat pup model of neonatal stroke[J].Pediatr Res,2007,62(3): 248-254.

[9]李燕華,孫善全.實(shí)驗(yàn)性腦出血后水通道蛋白4的表達(dá)變化[J].中華神經(jīng)科雜志,2004,37(2): 144-148.

[10]Manley GT,Fujimura M,Ma T,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].Nat Med,2000,6(2):159-163.

[11]Wenger RH.Cellular adaptation to hypoxia:O2-sensing protein hydroxylases,hypoxia-inducible transcription factors,and O2-regulated gene expression[J].FASEB J,2002,16(10):1151-1162.

[12]Gordan JD,Thompson CB,Simon MC.HIF and c-Myc: sibling rivals for control of cancer cell metabolism and proliferation[J].Cancer Cell,2007,12(2):108-113.

[13]Jin KL,Mao XO,Nagayama T,et al.Induction of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1alpha by global ischemia in rat brain[J].Neuroscience,2000,99(3):577-585.

[14]Bernaudin M,Tang Y,Reilly M,et al.Brain genomic response following hypoxia and re-oxygenation in the neonatal rat.Identification of genes that might contribute to hypoxia-induced ischemic tolerance[J].J Biol Chem,2002,277(42):39728-39738.

[15]Chen C,Hu Q,Yan J,et al.Early inhibition of HIF-1alpha with small interfering RNA reduces ischemic-reperfused brain injury in rats[J].Neurobiol Dis,2009,33(3):509-517.

Effect of Hypoxia on Expression of AQP4 and HIF-1α in Protein in Prefrontal Cortex of Rats

LI Min,DONG Zi-yu,CHEN Xue-qun

(Xinyang Vocational and Technical College,Xinyang 464000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats under hypoxic conditions for the basis of elucidating the mechanism of hypoxic brain edema.MethodsTwelve SD rats were randomly divided into the normal oxygen group and the hypoxia group.Rats in hypoxia group were exposed to hypoxia (7.8% O2，equal to 7 000 m altitude) in a hypobaric chamber for 8 h.The expression of AQP4 and HIF-1α protein in rat prefrontal cortex were determined by Western blot.ResultsAQP4 and HIF-1α protein were enhanced in the hypoxic rat prefrontal cortex after exposure to 7 000 m hypoxia for 8 h (P<0.05) by Western blot.ConclusionThe expression of AQP4 and HIF-1α protein in the prefrontal cortex of SD rats were increased after 8 h hypoxia.It was showed that HIF-1 might contribute to hypoxic brain edema by increasing the expression of AQP4 protein.

hypoxia；brain edema；aquaporin 4; hypoxia induced factor-1；HIF-1α

1672-688X(2016)03-0174-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.004

2016-05-10

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南信陽 464000

李敏(1987-)，女，河南信陽人，講師，從事生理學(xué)教學(xué)工作。

陳學(xué)群，女，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：chewy@zju.edu.cn

R364.4,R338.2+5

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