治中顆粒對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠顳葉神經(jīng)元凋亡的影響

王龍 張勇 黃燕 席麗娜 張明 呂建瑞

動(dòng)脈硬化性腦梗死是指大腦中動(dòng)脈系統(tǒng)的動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成使動(dòng)脈管腔狹窄，導(dǎo)致該動(dòng)脈供血區(qū)局部腦組織的壞死，臨床上表現(xiàn)為偏癱、講話不清等突然發(fā)生的神經(jīng)功能缺損癥狀[1]。該病為最常見的腦血管病，中醫(yī)藥治療腦栓塞有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，治中顆粒出自《備急千金要方》卷二十治中湯，主要成分為人參、干姜、甘草、(炙)、白術(shù)各9 g，用水1.6 L，煮取600 ml，去滓，每次溫服200 ml，3次/d。治五臟中寒，口噤失音，四肢強(qiáng)直。本文對(duì)該劑進(jìn)行了與功能主治有關(guān)的藥效學(xué)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠70只，體重180～220 g；由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)2015-002。大鼠晝夜循環(huán)光照,飼養(yǎng)在溫度19～28℃，相對(duì)濕度40%的潔凈環(huán)境中，喂食雙蒸水和購于動(dòng)物中心的大鼠飼料，大鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2 受試藥物 治中顆粒，用法用量：口服，5 g/次，3次/d；規(guī)格：5 g/袋，每袋相當(dāng)于12 g生藥；由西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，批號(hào)：20171103。銀杏葉片，用法用量：口服：2片/次，3次/d；規(guī)格：0.2 g；石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：170116。

1.3 試劑 枸櫞酸鈉，批號(hào)：20160718，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。枸櫞酸，批號(hào)：20160313，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。PBS磷酸緩沖液，批號(hào)：20180221，北京Solarbio科技有限公司。大鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)一抗，13A111，博士德生物工程有限公司。大鼠凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)一抗，13F57，博士德生物工程有限公司。多聚甲醛，批號(hào)：F20160417，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TMS-P超敏試劑盒，批號(hào)：1703261406，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB顯色試劑盒，批號(hào)：1705110031福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4 儀器 YG-280KX型陽光神琦攤片機(jī)。YG-280KX型陽光神琦烤片機(jī)。TP1020型徠卡自動(dòng)脫水機(jī)。Leica切片機(jī)。BX53型奧林巴斯光電顯微鏡。

1.5 研究方法

1.5.1 動(dòng)物分組、造模、給藥方法：70只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)選取10只為假手術(shù)組，其余60只大鼠隨機(jī)分為模型組、治中顆粒低劑量組(3.24 g生藥/kg)、治中顆粒中劑量組(6.48 g生藥/kg)、治中顆粒高劑量組(12.96生藥/kg)、銀杏葉片組(0.108 g/kg)，每組12只。給藥體積為10 ml·kg-1·d-1，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸餾水。大鼠腹腔注射6 ml/kg的水合氯醛溶液(5%)麻醉，大鼠仰臥位固定，頸部褪毛、消毒，分離、雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在其下置線備用。待所有大鼠自然蘇醒3 h后，用無創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min后，松夾進(jìn)行再灌注，止血后，涂青霉素粉，縫合皮膚。大鼠缺血30～60 s 內(nèi)昏迷，翻正反射消失、雙側(cè)瞳孔放大為造模成功，剔除6組因?qū)嶒?yàn)操作死亡的動(dòng)物。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈[2]。造模后繼續(xù)灌胃給藥14 d。

1.5.2 大鼠腦組織灌流方法:末次給藥1 h后，6組大鼠腹腔注射6 ml/kg 的水合氯醛溶液(5%)麻醉，大鼠仰臥位固定，開胸暴露心臟，將灌注針刺入左心室，右心耳剪孔，使用200 ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗，然后用4%多聚甲醛固定液灌流，直至身體逐漸僵硬震顫為止。開顱取腦，腦組織行冠狀位切片，置于4%多聚甲酸溶液(pH值7.4，0.01 mol/L PBS配制)中固定24 h。固定后的腦組織用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色以及Caspase-3和AIF在顳葉神經(jīng)元表達(dá)的檢測(cè)[3]。

1.5.3 大鼠腦顳葉神經(jīng)HE染色方法：切片用二甲苯(Ⅰ)透明15 min，二甲苯(Ⅱ)透明15 min， 100%乙醇(Ⅰ)浸泡5 min，100%乙醇(Ⅱ)浸泡5 min，80%乙醇浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min，蘇木精液染色 5 min，流水稍洗去蘇木精液3 s，1%鹽酸乙醇3 s，水洗30 s，0.5%伊紅液染色3 min，蒸餾水洗2 s，80%乙醇洗2 s，95%乙醇(Ⅰ)3 s，95%乙醇(Ⅱ)5 s，無水乙醇浸泡10 min，二甲苯(Ⅰ)浸泡2 min，二甲苯(Ⅱ)浸泡2 min，二甲苯(Ⅲ)浸泡2 min，中性樹膠封固。將切片置于200 倍顯微鏡下觀察6組大鼠顳葉皮層神經(jīng)元染色結(jié)果[4]。

1.5.4 免疫組化方法檢測(cè)大鼠腦顳葉神經(jīng)元Caspase-3和AIF的表達(dá)：石蠟切片，在烘箱中60℃烘烤3 h，然后切片用二甲苯(Ⅰ)透明15 min，二甲苯(Ⅱ) 透明15 min，100%乙醇(Ⅰ)浸泡5 min，100%乙醇(Ⅱ)浸泡5 min，80%乙醇浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min。用3%的H2O2去離子水孵育10 min。蒸餾水沖洗，使用PBS緩沖液浸泡3次，每次5 min。在檸檬酸鈉緩沖溶液中(pH值7.0)高壓修復(fù)5 min。室溫血清封閉15 min，傾去血清。滴加PBS稀釋的一抗(Caspase-3 1∶100，AIF 1∶200)，于37℃孵育2 h。使用PBS緩沖液浸泡3次，每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃孵育1 h,PBS浸泡3次，每次5 min。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶,于37℃孵育30 min。PBS浸泡3次，每次5 min。滴加(DAB)顯色劑顯色[5]。自來水沖洗。蘇木精液染色 5 min，流水稍洗去蘇木精液3 s，1%鹽酸乙醇3 s，水洗30 s，中性樹膠封片，免疫組化染色圖片采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各組積分光密度值(integral optical density IOD)。IOD = log[gv0/gv]，gv0 為背景灰度值，gv為目標(biāo)區(qū)灰度值[6]。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠腦顳葉皮層神經(jīng)元HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦顳葉皮層神經(jīng)元，結(jié)構(gòu)清晰、完整，胞漿透明，胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，形態(tài)正常；模型對(duì)照組，大鼠腦顳葉皮層出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷，細(xì)胞變性和死亡，細(xì)胞形態(tài)改變。腦顳葉皮層部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞腫脹、破裂，輪廓模糊、界限不清，變性損傷的神經(jīng)元失去了正常結(jié)構(gòu)，其胞體呈三角形，細(xì)胞質(zhì)濃縮、深染，細(xì)胞核固縮，核仁不明顯。給藥組與模型組相比均有所改善，其中治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組神經(jīng)元損傷程度具有較為明顯的改善。見圖1。

圖1 大鼠腦顳葉神經(jīng)元(HE×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組F 銀杏葉片組

2.2 6組大鼠腦顳葉神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)免疫組化圖片IOD值比較 與假手術(shù)組比較模型組Caspase-3表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 6組大鼠腦前顳葉Caspase-3的表達(dá)結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05

2.3 6組大鼠腦顳葉神經(jīng)元AIF表達(dá)免疫組化圖片IOD值比較 與假手術(shù)組比較模型組AIF表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組AIF表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2,圖3。

圖2 大鼠腦顳葉神經(jīng)元caspase-3表達(dá)結(jié)果(HE×200)；A 假手術(shù)組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組F：銀杏葉片組

表2 6組大鼠腦前顳葉AIF的表達(dá)結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較,*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

腦動(dòng)脈狹窄大腦由兩側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈供血，當(dāng)其中一條動(dòng)脈發(fā)生閉塞時(shí)，若側(cè)支循環(huán)良好，可不發(fā)生臨床缺血癥狀，如側(cè)支循環(huán)不良，或多條動(dòng)脈發(fā)生狹窄時(shí)，則會(huì)使局部或全腦的腦血流(減少，產(chǎn)生腦缺血癥狀[7]。輕度動(dòng)脈狹窄不影響血流量，當(dāng)動(dòng)脈縮窄至原有管腔橫斷面積的80%以上才足以使血流量減少。多條腦動(dòng)脈狹窄對(duì)腦血流的影響更大，因?yàn)榭赡苁谷X血流處于缺血的邊緣狀態(tài)，此時(shí)如果有全身性血壓波動(dòng)，就可能誘發(fā)腦缺血。造成腦動(dòng)脈狹窄的主要原因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化，且絕大多數(shù)累及顱內(nèi)的中等動(dòng)脈，其中以頸動(dòng)脈起始部受累的機(jī)會(huì)最多[8]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊除了可以造成動(dòng)脈管腔狹窄外，在斑塊上的附著物被血流沖刷脫落后形成栓子，隨血流進(jìn)入顱內(nèi)動(dòng)脈，堵塞遠(yuǎn)側(cè)動(dòng)脈引起腦栓塞，造成供血區(qū)缺血。栓子常來源于頸內(nèi)動(dòng)脈起始部的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。栓子可能很快分裂成碎片后溶解，或向遠(yuǎn)側(cè)動(dòng)脈移動(dòng)。頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)的栓子大多隨血液的主流進(jìn)入腦中動(dòng)脈，引起相應(yīng)的臨床癥狀。短暫的低血壓也可引起腦缺血，如果腦血管狹窄嚴(yán)重，使腦血流處于少血狀態(tài)時(shí)，輕度的血壓降低就可以引起腦缺血，如心肌梗死、休克、直立性低血壓等[9]。本研究中的治中顆粒，由人參、干姜、甘草、(炙)、白術(shù)組成，所含藥物具有擴(kuò)張動(dòng)脈及升高血壓的作用，因此可以用于治療腦缺血性疾病。

圖3 大鼠腦顳葉神經(jīng)元AIF表達(dá)結(jié)果(HE×200)；A假手術(shù)組；B 模型組；C 治中顆粒低劑量組；D 治中顆粒中劑量組；E 治中顆粒高劑量組；F 銀杏葉片組

由于神經(jīng)元本身儲(chǔ)存的能量物質(zhì)ATP或ATP代謝底物很有限，大腦需要持續(xù)的腦血流來供應(yīng)葡萄糖和氧。當(dāng)腦血流下降時(shí)，腦組織通過自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制來調(diào)節(jié)血流，最大限度地減少腦缺血對(duì)神經(jīng)元的影響[10]。但當(dāng)腦血流下降到一定閾值，腦自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制失代償，則可引起腦功能性或器質(zhì)性改變。腦血流<10～12 ml·100 g-1·min-1時(shí)，ATP耗竭，膜磷脂降解，K+從神經(jīng)元內(nèi)釋放到細(xì)胞外，Ca2+則大量進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，引起神經(jīng)元鈣超載，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Na+、Cl-和水分異常增加，細(xì)胞破壞死亡[11]。本研究結(jié)果表明大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎20 min后，大鼠腦顳葉皮層神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的損傷，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞變性和死亡，治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組與模型組相比神經(jīng)元損傷有明顯改善。

腦缺血后缺血核心區(qū)腦血流停止，細(xì)胞膜穩(wěn)定性被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，細(xì)胞死亡或凋亡，細(xì)胞凋亡是腦缺血后的細(xì)胞損害的主要形式，特別是缺血半暗區(qū)的神經(jīng)元或暫時(shí)性腦缺血伴再灌注等缺血程度相對(duì)較輕的區(qū)域[12]。形態(tài)學(xué)上細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為染色質(zhì)的濃縮和折疊或形成碎片，細(xì)胞皺縮，并在胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體[13]。Caspase為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。Caspase為存在于細(xì)胞質(zhì)中具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。Caspase是一類蛋白酶家族，Caspase-1亞族包含 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亞族包含Caspase-2、9；Caspase-3亞族包含Caspase-3、6、7、8、10。正常的細(xì)胞中，每一種Caspase都以非活化狀態(tài)存在的，這種非活化的Caspase稱作酶原，它是酶的非活性前體，其肽鏈比有活性的長一些，將多出的部分切除，就轉(zhuǎn)變成有活性的Caspase[14]。Caspase有兩類，分為起始者和執(zhí)行者,外來蛋白信號(hào)切割激活起始Caspase，起始Caspase切割執(zhí)行者Caspase并使之激活，被激活的執(zhí)行者Caspase通過對(duì)靶蛋白的水解，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)是一類存在于線粒體內(nèi)外膜間隙的保守的黃素蛋白。AIF具有雙重功能，在細(xì)胞正常的生理狀態(tài)下，AIF可作為線粒體氧化還原酶，能催化細(xì)胞色素c和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之間的電子傳遞；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡的刺激時(shí)， AIF從線粒體中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，然后進(jìn)入細(xì)胞核，引起細(xì)胞核內(nèi)DNA凝集并斷裂成50 kb大小的片段，這是其與典型細(xì)胞凋亡的區(qū)別[15]。本研究中與模型組比較治中顆粒中劑量組、治中顆粒高劑量組及銀杏葉片組Caspase-3、AIF表達(dá)顯著降低，說明治中顆?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)Caspase-3和AIF在神經(jīng)元中的表達(dá)，而抑制腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，治中顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)Caspase-3和AIF在神經(jīng)元中的表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注模型產(chǎn)生保護(hù)作用，以上藥效學(xué)結(jié)果為治中顆粒在臨床上治療腦缺血性疾病提供了試驗(yàn)依據(jù)。