土茯苓中落新婦苷含量測(cè)定方法改進(jìn)的研究

劉東平，廖啟元，劉娛姍

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽蕪湖 241000）

土茯苓中落新婦苷含量測(cè)定方法改進(jìn)的研究

劉東平，廖啟元，劉娛姍

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽蕪湖 241000）

目的：改進(jìn)15版《中國藥典》收載的土茯苓中落新婦苷含量測(cè)定方法。方法：以60%甲醇為溶劑，分別用回流法、超聲提取法制備供試品溶液，其余色譜條件同藥典進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：60%甲醇溶液超聲提取法測(cè)定落新婦苷含量較60%甲醇溶液回流提取法更高。結(jié)論：采用改進(jìn)后的測(cè)定方法能夠真實(shí)反映土茯苓中落新婦苷含量，有利于對(duì)單味土茯苓及復(fù)方中的質(zhì)量控制。

土茯苓；落新婦苷；含量測(cè)定；HLPC

土茯苓為百合科植物光葉菝葜 （Smilar glabra Roxb）的干燥根莖[1],主要分布于華東及西南地區(qū),具有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)等作用,臨床上主要用于治療鉤端螺旋體病以及用于鎮(zhèn)痛,利尿,保肝等[2-3]。2010版《中國藥典》及2015版《中國藥典》中含量測(cè)定方法相同[1]，供試品溶液的制備方法圴為60%甲醇為溶劑加熱回流提取。有文獻(xiàn)顯示[4]，測(cè)定目標(biāo)成分落新婦苷（2R,3R）存在新落新婦苷（2S,3S）、異落新婦苷（2R,3S）及新異落新婦苷（2S,3R）三種異構(gòu)體。作者在含量測(cè)定研究過程中發(fā)現(xiàn)，隨著加熱回流提取時(shí)間增加，土茯苓中落新婦苷含量會(huì)下降，而其它3種二氫黃酮類含量在上升，與正常延長提取時(shí)間，提取更完全的情況相反，而在以往的相關(guān)文獻(xiàn)[5]中并沒有對(duì)供試品制備過程中的加熱過程進(jìn)行研究。因此，本文對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了進(jìn)一步研究，選擇以60%甲醇為溶劑，采用中國藥典最常見的提取方法超聲提取法制備供試品溶液 （常用浸漬法和滲漉法提取效率差、有效成分提取不完全，60%甲醇溶劑不適宜用煎煮法），其余色譜條件同藥典進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 儀器

DIONEX U3000型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）（美國，戴安）；色譜柱：依利特 hypersil C18（5 um，4.6mm×250 mm）；萬分之一（BSA224S型）及十萬分之一（CPA225D）電子天平（瑞士，Sartorius）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.1.2 溶劑

除甲醇為色譜純、水為超純水外，其余試劑均為分析純。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

落新婦苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111 798-201 303），提取物新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供。

1.1.4 土茯苓

購自合肥和義堂中藥飲片有限公司 （批號(hào)：20 150 101）。經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥教研室趙寶林教授鑒定為百合科植物光葉菝葜（smilaxglabra roxb）的干燥根莖。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品與供試品溶液的制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的落新婦苷對(duì)照品12.45 mg，置25 mL量瓶中,用60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含498.0 ug的溶液。取新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷提取物適量，加60%甲醇制成每1 mL約含0.4 mg的溶液，作為色譜定性鑒別。

1.2.1.2 60%甲醇加熱回流提取供試品溶液的制備

取土茯苓粉末（過3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾紙濾過，取續(xù)濾液用0.22 um微孔濾膜過濾，即得。

1.2.1.3 60%甲醇超聲提取供試品溶液的制備

取土茯苓粉末（過3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置三角錐瓶中，精密加入60%甲醇100 mL，稱定重量，超聲提取1 h（暫定），放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾紙濾過，取續(xù)濾液用0.22 um微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2 色譜條件

HPLC設(shè)備：DIONEX U3000高效液相色譜儀；DAD檢測(cè)器；色譜柱：依利特hypersil C18；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61）；檢測(cè)波長：291 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 線性關(guān)系

精密量取落新婦苷對(duì)照品溶液 （498.0 μg/mL）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL分別至 10 mL量瓶中，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成24.9，49.8，99.6,149.4，249.0 μg/mL的一系列對(duì)照品溶液，精密吸取上述溶液10 μL進(jìn)樣,按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以峰面積（S）為橫坐標(biāo),對(duì)照品進(jìn)樣量（C,μg）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程: S=55433 C+192147,r=0.9999，落新婦苷在24.9～249.0 mg范圍內(nèi)峰面積（S）與濃度（C）呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 精密度

精密吸取質(zhì)量濃度為149.4 μg/mL的落新婦苷對(duì)照品溶液20 μL,按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,記錄色譜峰面積值，所得 RSD= 0.13%,表明儀器精密度均良好。

1.2.3.3 重復(fù)性

取同一樣品,按“1.2.1.3”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液,按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)定落新婦苷峰面積值,結(jié)果RSD為1.47%,表明該種測(cè)定方法重復(fù)性均良好。

1.2.3.4 加樣回收率

精密稱取落新婦苷對(duì)照品適量，加60%甲醇制成濃度為512 ug/mL落新婦苷對(duì)照品溶液，精密量取1 mL，分別加入到5份同一批樣品中，按“1.2.1.3”方法制備5份供試品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件的條件測(cè)定。結(jié)果加樣回收率為99.4%,RSD為1.21%，說明具有良好的加樣回收率。

1.2.4 測(cè)定法

分別吸取落新婦苷對(duì)照品溶液，新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷提取物溶液，60%甲醇回流提取供度品溶液及60%甲醇超聲提取供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。新落新婦苷提取物、落新婦苷對(duì)照品、新異落新婦苷提取物、異落新婦苷提取物，60%甲醇回流提取供試品及60%甲醇超聲提取供試品色譜圖分別見下面圖1～6。

圖1 新落新婦苷提取物溶液色譜圖

圖2 落新婦苷對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 新異落新婦苷提取物溶液色譜圖

圖4 異落新婦苷提取物溶液色譜圖

圖5 60%甲醇回流提取供試品色譜圖

圖6 60%甲醇超聲提取供試品色譜圖

2 結(jié)果

2.1 峰分析

關(guān)于土茯苓中二氫黃酮醇類成分已經(jīng)有具體的研究[4-5]，其主要有效成分是落新婦苷及其異構(gòu)體。根據(jù)圖1中新落新婦苷提取物的位置、圖2中落新婦苷對(duì)照品的位置、圖3中新異落新婦苷提取物的位置、圖4中異落新婦苷提取物的位置以及文獻(xiàn)[5]中的圖譜比較得出圖5和圖6中1號(hào)色譜峰，2號(hào)色譜峰、3號(hào)色譜峰、4號(hào)色譜峰分別代表新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷。根據(jù)文獻(xiàn)[4]推斷峰5號(hào)色譜峰代表的化合物是（2R，3R）-花旗松素-3’-o-β-D-吡喃葡萄糖苷，但有待進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2 二氫黃酮醇類各成分峰面積變化

在對(duì)色譜峰面積的研究中發(fā)現(xiàn)，從表1中看出加熱回流提取物中落新婦苷（2R,3R）及異落新婦苷（2R,3S）峰面積減少，而新落新婦苷（2S,3S）、新異落新婦苷（2S,3R）峰面積增加（注：以下表中各峰面積均為雙樣雙針平均值折算0.5 g土茯苓的峰面積，RSD分別為1.63%,1.76%）。而加熱回流提取與超聲提的落新婦苷及其三個(gè)異構(gòu)體即峰1、峰2、峰3、峰4的峰面積之和基本相同，說明加熱過程中，不同的對(duì)映異構(gòu)體會(huì)相互轉(zhuǎn)化。

表1 回流提取法與超聲提取法供試品各個(gè)峰面積變化

2.3 含量

批號(hào)20150101土茯苓按回流提取法落新婦苷含量為1.09%，按超聲提取法落新婦苷含量為1.58%。結(jié)果表明，按超聲提取法制備供試品溶液測(cè)定土茯苓中落新婦苷含量較回流提取法高。

2.4 超聲提取法制備供試品溶液的提取時(shí)間研究

按1.2.1.3方法，分別超聲15 min、30 min、45 min、60 min制備供試品溶液，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果如表2。顯示超聲30 min及以上時(shí)間土茯苓中落新婦苷含量基本不變，30 min已提出98.10%，因此，可將超聲時(shí)間定為30 min。（注：以下各峰面積均為雙樣雙針平均值折算0.5 g土茯苓的峰面積，RDS =1.35%）。

表2 測(cè)得茯苓中落新婦苷含量與提取時(shí)間關(guān)系

3 討論

從試驗(yàn)過程中看，土茯苓中落新婦苷及其三個(gè)異構(gòu)體在加熱過程中會(huì)有轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化為異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化，4個(gè)異構(gòu)體的總體含量在加熱前后基本不變。因此，在對(duì)單味土茯苓及復(fù)方中的質(zhì)量控制過程中，建議用60%甲醇溶液超聲提取30 min測(cè)定落新婦苷單獨(dú)含量和四個(gè)異構(gòu)體總體含量，才能比較好的把控該品質(zhì)量。落新婦苷及其三個(gè)異構(gòu)體藥理及毒理作用是否一致還是有較大區(qū)別，還未有文獻(xiàn)進(jìn)行研究，值得深入探究。

1.國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2015:14.

2.江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典:上冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986:91-93.

3.袁曙光.高耀風(fēng)重用土茯苓治療頑固性頭痛45例觀察[J].河北中醫(yī),1988,10（6）:4-5.

4.袁久志，竇德強(qiáng)，陳英杰，等.土茯苓二氫黃酮醇類成分研究[J].中國中藥雜志，2004,29（9）:867-870.

5.賈瑋,劉海,王崢濤.測(cè)定土茯苓中二氫黃酮醇類含量的UPLC法和HPLC法的建立與比較[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,40（4）:337-341.

6.王永奇,付曉雪,宋明明，等.落新婦苷及其異構(gòu)體和同系物藥源植物的研究進(jìn)展 [J].華西藥學(xué)雜志，2014,29（4）:463-466.

（2015-12-18收稿）

Optimization of the method for analyzing the amount of astilbin in Smilax glabra

Liu Dongping,Liao Qiyuan,Liu Yushan Department of Pharmacy of Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Wuhu 241000,Anhui Province,China

Objective：To improve the methed of aualyze the amount of astilbin in Smilax glabra,which listed in the 15th edition of the Chinese Pharmacopoeia was optimized.Methods：Using 60%methanol as solvent, the sample solution was prepared by reflux method,and followed by ultrasonic extraction,and the amount of astilbin was determined by chromatography as instructed in the Pharmacopoeia.Results:Using 60%methanol solution,the amount of astilbin obtained by ultrasonic extraction was higher than by refluxing extraction. Conclusion：The optimized extraction method can accurately measure the actual amount of astilbin in Smilax glabra,which provides a better quality control in analyzing the amount of astilbin in single or compound Smilax glabra.

milax glabra;Astilbin;Content determination;HLPC

R283.3

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.008

劉東平（1978-），男，講師,碩士。E-mail:liudongping588@163.com