芪雪浸膏劑質(zhì)量標準研究

陸　超　吳　磊　錢　芳　劉志輝*

（1南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，南京　210029；2南京中醫(yī)藥大學研究生院，南京　210046)

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芪雪浸膏劑質(zhì)量標準研究

陸超1，2吳磊1錢芳1劉志輝1*

（1南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，南京210029；2南京中醫(yī)藥大學研究生院，南京210046)

摘要：目的研究并建立芪雪浸膏劑的質(zhì)量控制標準。方法采用薄層色譜法對芪雪浸膏劑中的黃芪、當歸、虎杖、大黃、進行定性鑒別；采用HPLC-ELSD法研究并建立芪雪浸膏劑中黃芪甲苷的含量測定方法。結(jié)果處方中4味中藥均能在薄層色譜中檢出，分離效果好，斑點清晰，陰性未見干擾。黃芪甲苷進樣量在2.5～25 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 2），平均回收率96.62%，RSD為1.42%（n=6）。結(jié)論建立的方法簡便、可行、準確，可為芪雪浸膏劑質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芪雪浸膏劑；質(zhì)量標準；薄層色譜；高效液相色譜；黃芪甲苷

芪雪浸膏劑是根據(jù)江蘇省中醫(yī)院腎科孫偉教授的經(jīng)驗方制成的醫(yī)療機構(gòu)制劑，由黃芪、當歸、虎杖、土茯苓、制大黃、積雪草等11味中藥組成，具有補腎活血祛濁之功效，臨床應用治療慢性腎炎多年，療效顯著。本實驗采用薄層色譜（TLC）法對該制劑中的4味飲片進行了定性鑒別，并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法對君藥黃芪中的主要成分黃芪甲苷進行了含量測定研究，為芪雪浸膏劑質(zhì)量控制標準的建立提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Waters2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Alltech-ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech公司）；XWK-III無油空氣泵（天津市畢生分析儀器廠）；電子分析天平（BP-211D型，德國賽多利斯公司），醫(yī)用超聲波清洗儀（KQ-1000E型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2試藥黃芪甲苷對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號：110781-200613）；虎杖、大黃（藥用大黃）、當歸、中國食品藥品檢定研究院，鑒別用，批號依次為：120980-201005、120984-201202、121341-201404）；黃芪對照藥材（中國藥品生物制品檢定研究院，鑒別用，批號121462-201304）；硅膠G板（青島海洋化工）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

圖1　黃芪的薄層鑒別

圖2　當歸的薄層鑒別

圖3　虎杖的薄層鑒別

圖4　大黃的薄層鑒別

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1黃芪的TLC鑒別取芪雪浸膏劑12 g，加水100 ml使溶解，以水飽和正丁醇溶液振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺黃芪陰性對照溶液[1-2]。

取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另取黃芪對照藥材1 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，照供試品溶液制備方法，自“以水飽和正丁醇溶液振搖提取4次”起，依法制備對照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述四種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（10∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性未見干擾。見圖1。

2.1.2當歸的TLC鑒別取芪雪浸膏劑8 g，加水50 ml使溶解，稀鹽酸調(diào)pH值至2~3，用乙醚振搖提取2次，每次25 ml，合并提取液，揮干乙醚，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺當歸陰性對照溶液[3]。

另取當歸對照藥材0.5 g，加水30 ml，煎煮1 h，放冷，濾過，濾液備用。照供試品制備方法，自“稀鹽酸調(diào)pH值至2~3”起，依法制備對照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上，顯相同的藍色熒光斑點，陰性未見干擾。見圖2。

2.1.3虎杖的TLC鑒別取芪雪浸膏劑6 g，加水50 ml使溶解，乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺虎杖陰性對照溶液[4]。

另取虎杖對照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至1 ml，即得。

照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視?；⒄裙┰嚻飞V中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫色斑點，陰性未見干擾。見圖3。2.1.4大黃的TLC鑒別取芪雪浸膏劑12 g，加水50 ml使溶解，加鹽酸2 ml，加熱回流30 min，冷卻，用二氯甲烷振搖提取2次，每次40 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺大黃陰性對照溶液[5]。

另取大黃對照藥材0.5 g，加甲醇20 ml，浸漬1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 ml使溶解，照供試品溶液的制備方法，自“加鹽酸2 ml”起，依法制備對照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（30∶10∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上，顯相同的橙黃色斑點，氨熏后，斑點變?yōu)榧t色，陰性無干擾。結(jié)果見圖4。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Hedera C18 ODS-2(4.6 mm× 250 mm，5μm)；流動相：乙腈-水（33∶67）；流速：1.0ml·min-1；柱溫：30℃；進樣量20 μL；ELSD-2000檢測器：漂移管溫度為102℃，載氣流量為2.7 L·min-1[6-9]。

2.2.2溶液的制備對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇定容，制成每1 ml含0.5 mg的對照品溶液，即得。

供試品溶液的制備取芪雪浸膏劑12 g，加水100 ml使溶解，以水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，置于5 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制成缺黃芪陰性溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗取上述對照品溶液、供試品溶液和芪雪黃芪陰性溶液各20 μL，按上述色譜條件分別進樣，HPLC圖譜見圖4。結(jié)果表明，色譜峰基線平穩(wěn)，供試品與黃芪甲苷對照品在相同位置均有吸收，分離度良好且陰性無干擾，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于5000。

圖5　黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜圖

2.2.4標準曲線與線性范圍取上述對照品溶液，分別進樣5、10、20、30、40、50 μL，依法測定峰面積。以進樣量的自然對數(shù)為橫坐標X，響應值的自然對數(shù)為縱坐標Y，繪制標準曲線，經(jīng)統(tǒng)計學處理，得回歸方程Y=1.693X+11.96，r=0.999 2(n=6)。結(jié)果見圖6。

圖6　黃芪甲苷標準曲線圖

以上結(jié)果表明黃芪甲苷在2.5~25 μg范圍內(nèi)與峰面積進樣量對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗精密吸取對照品溶液15 μL，注入高效液相色譜儀中，重復進樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計RSD為1.86%，表明，儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1　黃芪甲苷精密度試驗結(jié)果

2.2.6重復性試驗取同一批號的芪雪浸膏劑12 g，共6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，依法測定，以黃芪甲苷含量計算樣品含量，RSD%為2.09%，表明該方法重復性良好。結(jié)果見表2。

表2　黃芪甲苷重復性試驗結(jié)果

2.2.7穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄峰面積，結(jié)果按黃芪甲苷峰面積計算，RSD為1.99%，表明黃芪甲苷在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3　黃芪甲苷穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.8加樣回收試驗精密量取已知黃芪甲苷含量的芪雪浸膏劑6 g，共6份，分別加入黃芪甲苷對照品(0.428 mg·mL-1)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取其中20 μL，注入高效液相色譜儀，測定，計算，結(jié)果見表4。

表4　加樣回收率試驗結(jié)果　?。╪=6）

2.2.9樣品含量測定取芪雪浸膏3批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣，測定，計算。結(jié)果3批樣品黃芪甲苷含量分別為0.1458 mg·g-1、0.1392 mg· g-1、0.1415 mg·g-1。

3　討論

芪雪浸膏劑處方共含有11味藥材，成分極其復雜，不同的中藥可能含有相同的化學成分成分，本文建立的薄層鑒別方法，均采用對照藥材為對照，增強了定性鑒別的準確性與可靠性，能較好地控制芪雪浸膏劑的質(zhì)量。

虎杖的薄層鑒別曾參考《藥典》方法[10]，用鹽酸加熱水解后，以二氯甲烷萃取，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開后晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，并以氨熏蒸，結(jié)果陰性有干擾。改用乙酸乙酯振搖提取，并以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16:3:1）為展開劑，置日光下檢視，鑒別點清晰，陰性未見干擾。

本文的含量測定，主要測定的是黃芪甲苷。黃芪作為方中君藥，其有效成分之一黃芪甲苷是黃芪特有的生物活性成分，功能補脾養(yǎng)血，益氣生津，可改善心肺功能，擴張血管，調(diào)節(jié)機體免疫功能等；故選擇黃芪甲苷作為該制劑含量測定的指標，方法學考察表明所建立的方法專屬性強，重現(xiàn)性好，可用于芪雪浸膏劑的質(zhì)量控制。

參考文獻

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2015年2月10日

Study on the quality standards of Qixue Concrete

LU Chao1,2,WU Lei1,QIAN Fang1,LIU Zhihui1*
(1.Department of Pharmacy,The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China; 2.Graduate School of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China)

Abstract:Objective To establish the quality standards for Qixue concrete.Methods Astragali Radix,Angelicae Sinensis Radix, Polygoni Cuspdati Rhizoma Et Radix,Smilacis Glabrae Rhizoma,Rhei Radix Et Rhizoma,Centeliae Herba and Abelmoschi Corolia in Qixue concrete were qualitatively identified by TLC.The content of astragalosideⅣwas determined by HPLC-ELSD.Results Six herbs could be identified by TLC,and the spots were clear and well-separated.The linear range of AstragalosideⅣwas 2.5～25.Μg (r=0.999 2),and the average recovery was 96.62%,RSD=1.42%(n=6).Conclusion The method is simple and accurate,and it can be used for the quality control of Qixue concrete.

Keywords:Qixue concrete;quality standard;TLC;HPLC;AstragalosideⅣ

收稿日期：（本文編輯：張文娟本文校對：朱敏2015-12-17）

*通訊作者：liuzh1008@126.com

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2016.04.066

文章編號：1672-2779（2016）-04-0135-04