孟魯司特對哮喘小鼠氣道重構(gòu)的干預(yù)機(jī)制研究

滕 鴻胡 敏

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孟魯司特對哮喘小鼠氣道重構(gòu)的干預(yù)機(jī)制研究

滕 鴻1胡 敏2

【摘要】目的 建立哮喘小鼠氣道重構(gòu)模型，觀察孟魯司特對哮喘小鼠氣道重構(gòu)的影響，探討其機(jī)制。方法 建模成功后，將動物分為四組：孟魯司特（MK）干預(yù)組，激素（DXM）干預(yù)組、陰性對照組，陽性對照組。HE染色及阿爾新蘭染色，分別觀察支氣管上皮細(xì)胞及粘液分泌情況。圖像分析軟件測定支氣管平滑肌厚度確定不同組別氣道重構(gòu)程度。采用半定量PCR法檢測小鼠精氨酸酶-Ⅱ mRNA水平。結(jié)果（1）陽性組出現(xiàn)粘液分泌增加、炎癥細(xì)胞浸潤、管壁增厚、平滑肌增生等，精氨酸酶-Ⅱ mRNA水平增高；（2）MK組、DXM組炎癥反應(yīng)輕微，粘液分泌、平滑肌增生不明顯。與陽性組比較，MK組、DXM組精氨酸酶-ⅡmRNA水平降低；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 發(fā)生氣道重構(gòu)哮喘小鼠的精氨酸酶-Ⅱ表達(dá)水平升高，MK干預(yù)可降低精氨酸酶-Ⅱ mRNA水平，改善哮喘小鼠氣道重構(gòu)。

【關(guān)鍵詞】哮喘氣道重構(gòu)；孟魯司特；精氨酸酶-Ⅱ

A Study on the Mechanism of Cysteinyl Leukotriene Receptor Antagonist on the Airway Remodeling of Asthmatic Mice Models

TENG Hong1HU Min21 People’s Hospital of Sichuan Province，Department of Respiratory，Chengdu 610072，China，2 Sichuan University，West China Second University Hospital，Open Lab，Chengdu 610041，China

【Abstract】

Objective To investigate the effectiveness of cysteinyl leukotriene receptor antagonist（montelukast，MK）on the pathological features and the transcription level of Arginase-Ⅱ in the asthmatic mice models.Methods Mice were randomly divided into the control，asthmatic，MK，and DXM groups.The thickness of the smooth muscle（WAm）of intrapulmonary bronchi was measured by image analysis system.The function of airway goblet cells was estimated by alcian blue staining.mRNA levels for arginase-Ⅱ were determined by RT-PCR.Results Obvious infiltration of inflammatory cells and proliferation of goblet cells and smooth muscle were demonstrated in mouse bronchus.Transcription levels of arginase-Ⅱ in the lung tissue were significantly higher than those of control group.Compared with asthmatic group，there was mild inflammation and collagen deposition in MK-treated and DXM-treated groups.Conclusion Repeated exposure of allergen induced airway inflammation and remodeling.Arginase-Ⅱ plays an important role in airway remodeling.MK and DXM intervention could inhibit airway remodeling through the way to reduce the levels of arginase-Ⅱ.

【Key words】Asthma airway remodeling，Leukotriene receptor antagonist，Arginase-Ⅱ

參與氣道重構(gòu)的細(xì)胞不僅有嗜酸粒細(xì)胞﹑T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞﹑巨噬細(xì)胞﹑成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞﹑氣道平滑肌細(xì)胞也參與氣道重構(gòu)，導(dǎo)致上皮下纖維化﹑杯狀細(xì)胞化生﹑粘液腺肥大﹑平滑肌增生﹑細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增加［1］。白三烯受體拮抗劑其機(jī)制除抑制白三烯誘發(fā)的氣道炎癥外，是否有其他的途徑參與預(yù)防和治療哮喘氣道重構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

本研究通過觀察慢性哮喘小鼠模型中使用孟魯司特和地塞米松干預(yù)后精氨酸酶-Ⅱ表達(dá)水平的改變，了解孟魯司特對哮喘氣道重構(gòu)的預(yù)防及治療機(jī)制是否涉及精氨酸酶及其代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 哮喘小鼠氣道重構(gòu)模型的建立

BALB/c小鼠32只，6周齡，體重20 g左右，習(xí)服3 d后隨機(jī)分為：孟魯司特（MK）干預(yù)組，激素（DXM）干預(yù)組﹑陰性對照組，陽性對照組。除陰性對照組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1 d和第15 d腹腔注射0.1 ml 混懸液（氫氧化鋁凝膠2 mg加卵蛋白100 μg）致敏；霧化吸入1%卵蛋白（OVA）氣溶膠，分別于第2周1 d，第4周1～3 d，第8周1 d，第9周1 d，第10周4～6 d，每次20 min。予管喂MK 0.02 mg/只，每次激發(fā)前1.5 h給藥，第15 d后，當(dāng)天激發(fā)時用藥外，隔日管喂相同劑量至第11周。每次予腹腔注射DXM 0.02 mg/只，激發(fā)前0.5 h給藥，其余同MK組。用生理鹽水對陰性對照組進(jìn)行致敏和激發(fā)。成功的動物模型是小鼠出現(xiàn)明顯的口唇紫紺﹑呼吸急促，腹肌收縮。

1.2 標(biāo)本的制備與檢測

末次激發(fā)2 d后處死小鼠。小鼠右肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色及阿爾新藍(lán)染色。左肺置于液氮中保存?zhèn)溆?。采用圖像分析軟件（Image pro plus 5.0），將HE染色的切片放大200倍，顯微鏡下找到完整的支氣管橫斷面，測定總管壁面積（WAt）﹑內(nèi)壁面積（WAi）﹑平滑肌面積（WAm）﹑支氣管基底膜周徑（Pbm）﹑并用Pbm將測量值標(biāo)化，分別以WAt/Pbm﹑WAi/Pbm﹑WAm/ Pbm代表相應(yīng)管壁層的厚度。Trizol提取肺組織總RNA；合成cDNA；精氨酸酶Ⅱ上游引物（5’GAT CTC TGT GTC ATC TGG GTT G 3’），精氨酸酶Ⅱ下游引物（5’CAA TCA GCC GAT CAA ATG TCT G 3’）。瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，用β-actin進(jìn)行標(biāo)化凝膠成像分析系統(tǒng)讀取的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用q檢驗(yàn)了解組間差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理改變

常規(guī)HE染色陽性對照組見支氣管粘膜皺襞增多，肺泡間隔增厚，致管腔狹窄。有大量炎性細(xì)胞浸潤在粘膜下﹑管壁及肺泡間質(zhì)，支氣管上皮細(xì)胞脫落；MK組和DXM組見支氣管上皮﹑肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，偶見上皮細(xì)胞脫落，肺泡間隔稍增厚；少量炎性細(xì)胞浸潤在粘膜及粘膜下，明顯輕于哮喘組。阿爾新藍(lán)染色可見陽性對照組大量染成藍(lán)色的杯狀細(xì)胞和粘液。MK組和DXM組可見少量上皮組織染成藍(lán)色，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組平滑肌厚度及面積

總管壁面積（WAt）﹑內(nèi)壁面積（WAi）﹑平滑肌面積（WAm）經(jīng)支氣管基底膜周徑標(biāo)化后為WAt/Pbm﹑WAi/Pbm﹑WAm/Pbm，代表管壁的厚度。哮喘組支氣管平滑肌和管壁明顯增厚，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)MK和DXM干預(yù)后，平滑肌和管壁厚度變?。≒＜0.05），與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1　哮喘組、對照組、MK組、DXM組平滑肌和管壁厚度比較（μm，n=4，±s）

表1　哮喘組、對照組、MK組、DXM組平滑肌和管壁厚度比較（μm，n=4，±s）

注：MK組、DXM組與對照組比較P＞0.05，MK組、DXM組與哮喘組比較P＜0.05

WAt/Pbm　 WAi/Pbm　 WAm/Pbm對照組哮喘組DXM組MK組15.6±1.6 19.6±2.3 14.9±2.1 16.4±3.1 17.2±2.0 24.3±3.0 18.9±2.2 20.0±2.6 2.8±0.9 5.9±1.5 3.2±1.1 3.8±0.9

2.3 肺組織中精氨酸酶-ⅡmRNA含量

經(jīng)MK﹑DXM干預(yù)后，精氨酸酶-ⅡmRNA水平降低。哮喘組肺組織中精氨酸酶-ⅡmRNA轉(zhuǎn)錄水平高于對照組，結(jié)果見表2。

表2　各組小鼠肺組織精氨酸酶-Ⅱ相對含量（±s）

表2　各組小鼠肺組織精氨酸酶-Ⅱ相對含量（±s）

注：哮喘組與DXM組、MK組比較P＜0.05

哮喘組 　MK組　對照組　DXM組arginase-Ⅱ　1.40±0.13　 0.21±0.03　 0.14±0.03　 0.23±0.04

3 討論

哮喘氣道重構(gòu)是一種復(fù)雜的多細(xì)胞參與的病理過程，一般認(rèn)為氣道重構(gòu)是不可逆的，但有證據(jù)顯示白三烯受體拮抗劑能在一定程度上影響氣道重構(gòu)，它的干預(yù)主要表現(xiàn)在抑制氣道炎癥，對氣道重構(gòu)的作用更多的是間接效應(yīng)［2］。Henderson［3］在小鼠哮喘模型中發(fā)現(xiàn)孟魯司特可降低嗜酸粒細(xì)胞在氣道的浸潤﹑杯狀細(xì)胞增多，使上皮下膠原沉積及氣道平滑肌體積增加減輕。Muz［4］在小鼠模型中也有類似發(fā)現(xiàn)，且發(fā)現(xiàn)孟魯司特可顯著減輕氣道上皮脫落。本研究也可以看出，哮喘組小鼠的炎性細(xì)胞浸潤在外周細(xì)支氣管明顯增多，粘液分泌增多及杯狀細(xì)胞增生，可見氣道平滑肌及肺泡間隔增厚。經(jīng)孟魯司特和激素干預(yù)后，上述改變均出現(xiàn)不同程度的改善。

通過基因芯片方法，Zimmermann［5］發(fā)現(xiàn)正常對照幾乎檢測不到精氨酸酶的表達(dá)，相反哮喘患者精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)水平增高。精氨酸酶活性在哮喘小鼠模型中升高，作為精氨酸酶的下游產(chǎn)物-腐胺水平也升高。經(jīng)過IL4﹑IL13刺激后，肺組織中精氨酸酶活性和mRNA表達(dá)水平升高。IL13誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)（AHR）與精氨酸酶升高平行。哮喘患者血清腐胺﹑脯氨酸水平升高［6］。巨噬細(xì)胞﹑氣道上皮和平滑肌細(xì)胞均可表達(dá)腐胺 ，其合成的限速酶是精氨酸酶。哮喘患者血清精氨酸酶活性增加［7］，精氨酸生物利用度降低。精氨酸酶和一氧化氮合酶（NOS）的共同底物是精氨酸。通過競爭nNOS底物內(nèi)源性精氨酸酶能減少上皮來源的NO，使非腎上腺素﹑非膽堿能神經(jīng)介導(dǎo)的氣道平滑肌舒張受抑制［8］。減少了cNOS的產(chǎn)物，精氨酸酶在一定程度上促進(jìn)了氣道重構(gòu)。臨床上通過檢測呼出氣NO來了解氣道反應(yīng)性。有研究顯示白三烯受體拮抗劑能降低呼出氣NO濃度，推測其機(jī)制與降低精氨酸酶含量或活性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織精氨酸酶Ⅱ表達(dá)水平高于對照組。經(jīng)孟魯司特﹑激素干預(yù)后，精氨酸酶水平下降。

綜上所述，精氨酸酶途徑可能是哮喘治療潛在的靶點(diǎn)，也是孟魯司特影響哮喘氣道重構(gòu)的分子機(jī)制之一，為哮喘的早期干預(yù)治療提供了理論依據(jù)。孟魯司特早期使用能降低精氨酸酶的表達(dá)，一定程度延緩氣道重構(gòu)的發(fā)生。該研究還需在哮喘人群中應(yīng)用及進(jìn)一步驗(yàn)證。

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doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.02.136

【中圖分類號】R562.25

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）02-0183-03

作者單位：1 610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（四川省人民醫(yī)院）呼吸內(nèi)科；2 610041 成都，四川大學(xué)華西第二醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室