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    內皮素-1在心房顫動發(fā)生中的機制探討

    2016-04-01 09:35:15洪鈺杰鐘國強蔣智淵方曙孫培震
    中國循環(huán)雜志 2016年2期
    關鍵詞:心耳內皮素心房

    洪鈺杰,鐘國強,蔣智淵,方曙,孫培震

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    內皮素-1在心房顫動發(fā)生中的機制探討

    洪鈺杰,鐘國強,蔣智淵,方曙,孫培震

    摘要

    關鍵詞心房顫動;內皮素-1;心房纖維化

    作者單位:530021 廣西省南寧市,廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 心血管內科

    Effect of Endothelin-1 on Atrial Fibrosis in Patients With Atrial Fibrillation

    HONG Yu-jie, ZHONG Guo-qiang, JIANG Zhi-yuan, FANG Shu, SUN Pei-zhen.
    Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China
    Corresponding Author: ZHONG Guo-qiang, Email: gq_zhong@126.com

    Abstract

    Objective: To explore the effect of endothelin-1 on atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation (AF).

    Methods: A total of 72 patients with thoracotomy were studied, the patients were divided into 2 groups: AF group, n=39 and Sinus rhythm (SR) group, n=33.The mRNA and protein expressions of endothelin-1 (ET-1), platelet derived growth factor-B (PDGF-B) and collagen I (COL1) in right atrial appendage (RAA) tissue were measured by RT-PCR and Western blot analysis; meanwhile, the impact of ET-1 stimulation and non-selective ET-1 receptor antagonist (sulfafurazole SIZ) on PDGF-B mRNA and protein expressions in H9c2 cells were measured.

    Results: ①The RAA tissue mRNA and protein expressions in AF group were higher than those in SR group, as for ET-1 (2.830 ± 2.276) vs (1.220 ± 0.887) and (0.835 ± 0.241) vs (0.286 ± 0.083), both P<0.01; for PDGF-B (2.568 ± 2.348) vs (1.567 ± 0.831) and (0.807±0.241) vs (0.381 ± 0.105), both P<0.05; for COL1 α1 (3.376 ± 1.598) vs (1.629 ± 0.833) and (0.652 ± 0.210) vs (0.312 ± 0.12), both P<0.05.②The protein expressions of ET-1 and COL1 had positive correlation (r=0.580, P<0.01).③ET-1 promoted PDGF-B secretion in H9c2 cells in a concentration and time-dependent manner; SIZ could reduce such promotion.

    Conclusion: ET-1 plays an important role in AF occurrence which might be related to PDGF-B regulation.

    Key words Atrial fibrillation; Endothelin-1; Atrial fibrosis

    (Chinese Circulation Journal, 2016,31:146.)

    心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常,致殘、致死率高。房顫發(fā)病機制復雜,心房重構是其中心環(huán)節(jié)。心房纖維化作為心房結構重構最顯著的特征,與房顫的發(fā)生密切相關[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),房顫患者心房組織和外周血內皮素-1(ET-1)表達升高[2-5],但ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用,目前尚不清楚。已有的研究表明,ET-1與心肌纖維化密切相關[6],并且ET-1對血小板衍生生長因子(PDGF)具有調控作用[7]。PDGF-B是重要的致心房纖維化因子[8],ET-1是否通過調控PDGF-B促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生?目前尚少見報道。本研究旨在初步探討ET-1在房顫發(fā)生中的作用和可能的作用機制。

    1 資料與方法

    對象:選擇2012-10至2014-06我院心臟外科住院的72例心臟外科手術患者為研究對象,分為房顫組(39例)和竇性心律(竇律)組(33例)。其中,心臟瓣膜病患者61例,房間隔缺損患者6例,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者5例。排除標準:(1)合并感染性心內膜炎;(2)合并風濕活動征象;(3)高血壓;(4)內分泌紊亂、甲狀腺功能亢進;(5)自身免疫性疾??;(6)嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤;(7)年齡<18歲;(8)心臟二次手術者。本研究所有入選患者簽署書面知情同意書,并獲得廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

    兩組患者性別、年齡、基礎心臟疾病(除外聯(lián)合瓣膜病變)、紐約心臟協(xié)會(NYHA)心功能等差異無統(tǒng)計學意義,但房顫組患者左心房內徑明顯大于竇律組(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。(表1)

    右心耳標本獲取:于建立體外循環(huán)插腔靜脈管前,切開右心耳時切取約150 mg右心耳組織,部分放入液氮中凍存,部分用4%多聚甲醛固定。

    細胞培養(yǎng):H9c2細胞系(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)在含有10% 胎牛血清(Gibco),2 mM 谷氨酰胺,100 U/ ml 青霉素和100 μg/ ml鏈霉素的HG-DMEM 培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁和生長情況,待細胞約80%~90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細胞傳代,按1:2分瓶接種,每隔48~72 h更換培養(yǎng)基1次。

    ET-1干預H9c2細胞:ET-1(PROSPEC)干預前H9c2細胞以無血清培養(yǎng)基同步化24 h。H9c2細胞在含ET-1(0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h;此后,H9c2細胞在含ET-1 10 nmol/L培養(yǎng)基中,分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 、72 h;最后,H9c2細胞在含ET-1 10 nmol/L+ SIZ[9](Sigma,美國)2 mmol/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

    表1 兩組患者一般臨床資料的比較[例(%)]

    右心耳組織馬松(Masson)染色:右心耳組織固定后石蠟包埋,制成5 μm石蠟切片,脫蠟、梯度酒精脫水處理,蘇木素—伊紅染色10 min,Masson復合染液染色5 min,0.2%磷酸鎢酸處理切片5~10 min,0.2%醋酸水溶液浸洗2次。亮綠染色5 min,常規(guī)無水乙醇脫水、透明及封固,光學顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野進行拍照。

    實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR):(1)組織及細胞總RNA提?。?Trizol(Invitrogen)提取組織和細胞總RNA,NanoDrop2000型微量分光光度計測定RNA的OD280/OD260值(1.8~2.0);(2)cDNA合成:按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA)試劑盒說明書操作,進行總RNA逆轉錄反應;(3)引物設計與合成:人ET-1、PDGF-B、I型膠原α1亞基(COL1α1)和內參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物,大鼠PDGF-B和內參照GAPDH引物由日本TAKARA公司設計合成(表2);(4)熒光定量PCR: 按SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TAKARA)說明書操作,使用ABI 7300熒光定量PCR儀檢測人ET-1、PDGF-B、COL1α1,大鼠PDGF-B mRNA相對表達量,結果以2-△△CT表示。

    表2 基因引物序列

    蛋白免疫印跡(Western blot)檢測:提取右心耳組織和細胞總蛋白,各蛋白樣孔蛋白上樣總量30 μg;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);濕法轉膜;孵育一抗(4℃過夜):抗ET-1鼠單克隆抗體 (Abcam) 1:500、抗PDGF-B兔單克隆抗體(Abcam) 1:1 000、抗COL1鼠單克隆抗體(Abcam) 1:500、抗GAPDH鼠單克隆抗體(Sigma)1:10 000;孵育二抗(常溫1~2 h):熒光標記羊抗鼠IgG抗體(Licor) 1:10 000、熒光標記羊抗兔IgG抗體(Rockland)1:10 000;Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃膜,以GAPDH為內參照,檢測人ET-1、PDGF-B、COL1及大鼠PDGF-B蛋白相對表達,結果以目的蛋白條帶與相應內參蛋白條帶的灰度值比值表示。

    統(tǒng)計學分析:采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,計數(shù)資料以率或百分比表示;兩組間計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;多組間總體均數(shù)的比較采用單因素方差分析,多組間均數(shù)兩兩比較,采用q檢驗;單因素相關分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1兩組患者右心耳ET-1表達

    房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達水平(2.830±2.276)明顯高于竇律組(1.220 ±0.887)(t=4.068,P<0.01);蛋白表達水平(0.835±0.241)亦明顯高于竇律組(0.286±0.083)(t=-13.309, P<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。(圖1A)

    2.2兩組患者右心耳PDGF-B表達

    房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達水平(2.568±2.348)明顯高于竇律組(1.567 ±0.831)(t=2.482,P<0.05);蛋白表達水平(0.807±0.241)亦明顯高于竇律組(0.381±0.105)(t=-10.860,P<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。(圖1B)

    2.3兩組患者右心耳COL1表達

    房顫組患者右心耳COL1α1 mRNA表達水平(3.376±1.598)明顯高于竇律組(1.629±0.833)(t=5.941,P<0.05);COL1蛋白表達水平(0.652±0.210)亦明顯高于竇律組(0.312±0.122) (t=-8.565,P<0.05),差異均有統(tǒng)計學意義。(圖1C)

    注:AF:房顫組;SR:竇律組;ET-1:內皮素-1;PDGF-B:血小板衍生生長因子-B;COL1:I型膠原;GAPDH: 磷酸甘油醛脫氫酶

    2.4ET-1與COL1相關性分析

    單因素相關分析顯示兩組患者右心耳COL1蛋白表達水平與ET-1蛋白表達水平呈明顯的正相關(r=0.580,P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。

    2.5兩組患者右心耳膠原纖維沉積

    Masson染色提示房顫組患者右心耳膠原纖維沉積明顯多于竇律組患者,呈粗大的束狀包裹、分隔心肌纖維。(圖2)

    圖2 兩組患者右心耳膠原纖維沉積

    2.6ET-1對H9c2細胞PDGF-B分泌的影響

    (1)不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B mRNA表達的影響:與0 nmol/L(1.043±0.102)比較,1 nmol/L ET-1(1.314±0.131,q=6.335,P<0.01)、10 nmol/L ET-1(1.671±0.131,q=14.687,P<0.01)、100 nmol/L ET-1(1.973±0.145,q=21.737,P<0.01)、H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平明顯升高,且1 nmol/L、10 nmol/L (q=8.352,P<0.01)、100 nmol/L (q=7.050,P<0.01) PDGF-B mRNA表達水平進行性升高,差異有統(tǒng)計學意義。

    (2)不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響:與0 nmol/L(0.070±0.028)比較,1 nmol/L ET-1(0.163±0.025,q=7.111,P<0.01)、10 nmol/L ET-1(0.355±0.043,q=21.792,P<0.01)、100 nmol/L ET-1(0.623±0.053,q=42.267,P<0.01)H9c2細胞PDGF-B蛋白表達水平明顯升高,且1 nmol/L、10 nmol/L (q=14.681,P<0.01)、100 nmol/ L(q=20.475,P<0.01)PDGF-B蛋白表達水平進行性升高,差異有統(tǒng)計學意義。(圖3)

    圖3 不同濃度ET-1對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響

    (3)ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B mRNA表達的影響:與0 h(0.966±0.131)比較,24 h(1.671±0.131,q=13.151,P<0.01)、48 h(1.999±0.178,q=19.277,P<0.01)、72 h (2.278±0.194,q=24.462,P<0.01)H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平明顯升高,且24 h、48 h (q=6.126,P<0.01)、72 h(q=5.185,P<0.01)PDGF-B mRNA表達水平進行性升高,差異有統(tǒng)計學意義。

    (4)ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響:與0 h(0.069±0.019)比較,24 h(0.355±0.043,q=23.428,P<0.01)、48 h (0 .6 2 8±0 .0 3 8,q = 4 5 .7 6 9,P< 0 .0 1)、72 h(0.750±0.041,q=55.721,P<0.01) H9c2細胞PDGF-B蛋白表達水平明顯升高,且24 h、48 h(q=22.341,P<0.01)、72 h(q=9.952,P<0.01)PDGF-B蛋白表達水平進行性升高,差異有統(tǒng)計學意義。(圖4)

    圖4 ET-1培養(yǎng)不同時間對H9c2細胞PDGF-B蛋白表達的影響

    (5)內皮素拮抗劑對ET-1培養(yǎng)下H9c2細胞PDGF-B表達的影響:與10 nmol/L ET-1比較,ET-1 10 nmol/L+ SIZ 2 mmol/L的H9c2細胞PDGF-B mRNA表達水平(1.426±0.130)明顯下降(t=3.633,P<0.01);PDGF-B蛋白水平(0.246±0.022)也明顯下降(t=6.510,P<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。(圖3)

    3 討論

    內皮素是一種由21個氨基酸殘基組成的活性多肽,主要由內皮細胞分泌,心肌細胞和成纖維細胞等也有一定表達。ET-1是人體最主要的內皮素,它促進成纖維細胞向肌樣成纖維細胞分化,增加細胞外基質合成,是導致心肌纖維化的重要因素[6,10-12]。

    近來,ET-1在房顫發(fā)病中的作用越來越受重視。Zakeri 等[3]研究表明,與單純的心力衰竭患者相比,合并房顫者血漿ET-1表達更高。Abed等[13]研究發(fā)現(xiàn),隨著山羊體重的增加,其心房ET-1及內皮素受體ETA和ETB表達增加,房顫發(fā)生的風險明顯升高。Mayyas等[14]發(fā)現(xiàn)通過飲食補充ω3不飽和脂肪酸可以減少實驗犬心臟術后房顫的發(fā)生,并且降低血漿ET-1表達。Nakazawa等[15]發(fā)現(xiàn)術前血漿ET-1表達水平是預測環(huán)肺靜脈消融術后3~6個月復發(fā)率的重要指標。Latini等[16]也發(fā)現(xiàn),房顫時血漿ET-1前體肽增加,是預測房顫復發(fā)的良好指標。上述研究的共同特點在于,房顫時血漿或是心房ET-1表達明顯升高,可見ET-1過度表達在房顫發(fā)病中起著重要作用。遺憾的是,上述研究均未對ET-1在房顫發(fā)病中的具體作用進行深入的研究。

    我們的研究發(fā)現(xiàn),房顫組患者右心耳ET-1、COL1表達以及膠原纖維沉積均明顯高于竇律組,且兩組患者右心耳COL1表達水平與ET-1表達水平呈明顯的正相關,提示ET-1可能通過促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生。Mayyas等[4]研究結果與我們的研究相似,他們發(fā)現(xiàn)器質性心臟病患者左心耳ET-1表達水平與左心房大小、心房纖維化程度以及房顫的發(fā)生有明顯的相關性。

    我們的研究還發(fā)現(xiàn),ET-1可以促進H9c2細胞PDGF-B mRNA和蛋白的合成,并且表現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。SIZ可以減弱ET-1對H9c2細胞PDGF-B合成的促進作用。上述結果表明ET-1可在基因轉錄水平對PDGF-B信號通路進行調控。

    PDGF是多種間充質來源細胞(如成纖維細胞、血管平滑肌細胞等)的主要絲裂原,促進間充質細胞生長、遷移、增殖、分化及細胞外基質的合成,在組織損傷后修復中起著重要作用。但病理狀態(tài)下,過度激活的PDGF可使成纖維細胞轉化為肌樣成纖維細胞,分泌多種細胞外基質,導致心房纖維化,促進房顫的發(fā)生[8]。PDGF主要以旁分泌的形式作用于其效應細胞,其受體(PDGFR)在成纖維細胞高度表達[17],因此心房成纖維細胞是PDGF最主要的效應細胞之一。據(jù)此我們推測,ET-1可能通過刺激心房肌細胞合成PDGF-B,并以旁分泌的形式作用于心房成纖維細胞,促進其分泌細胞外基質,導致心房纖維化和房顫的發(fā)生。

    我們的研究表明,ET-1可能通過上調PDGF-B促進心房纖維化而參與房顫的發(fā)生,有望為房顫的干預提供新的靶點。但目前只是體外實驗的結果,有待于體內實驗進一步驗證。另一方面,由于病例數(shù)有限,研究中大部分為心臟瓣膜病患者,僅有少部分為非心臟瓣膜病患者,ET-1在非瓣膜病性房顫中的作用是否如此,仍有待考證。進一步收集病例,探討ET-1在不同基礎心臟疾病房顫發(fā)生中的作用,將更加有利于問題的闡明。此外,ET-1促進心肌細胞PDGF-B分泌的具體機制仍有待進一步探索,我們將在今后的研究中逐步完善。

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    (編輯:漆利萍)

    收稿日期:(2015-05-20)

    中圖分類號:R54

    文獻標識碼:A

    文章編號:1000-3614(2016)02-0146-05

    doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.02.011

    作者簡介:洪鈺杰 碩士研究生 主要從事心律失常的基礎與臨床研究 Email:15077177145@163.com 通訊作者:鐘國強Email:gq_zhong@126.com

    基金項目:廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019167) ;國家自然科學基金課題地區(qū)科學基金項目(81460057)

    目的:探討內皮素-1(ET-1)在心房顫動(房顫)和心房纖維化中的作用。

    方法:72例開胸手術患者,分為房顫組(39例)和竇性心律(竇律)組(33例)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)分別檢測兩組患者右心耳ET-1、血小板衍生生長因子-B(PDGF-B)、I型膠原(COL1)mRNA和蛋白表達水平。同時,檢測ET-1刺激以及非選擇性ET-1受體拮抗劑(磺胺異惡唑,Sulfafurazole,SIZ)對H9c2細胞PDGF-B mRNA和蛋白表達水平的影響。

    結果:(1)房顫組患者右心耳ET-1 mRNA表達水平和蛋白表達水平明顯高于竇律組(2.830±2.276 vs 1.220 ±0.887)和(0.835±0.241 vs 0.286±0.083),P均<0.01。房顫組患者右心耳PDGF-B mRNA表達水平和蛋白表達水平明顯高于竇律組(2.568±2.348 vs 1.567±0.831)和(0.807±0.241 vs 0.381±0.105),P均<0.05。房顫組患者右心耳I型膠原α1亞基(COL1α1) mRNA表達水平(3.376±1.598) 明顯高于竇律組(1.629±0.833),P<0.05;蛋白表達水平(0.652±0.210)亦明顯高于竇律組(0.312±0.122),P<0.05。(2)兩組患者右心耳I型膠原蛋白表達水平與ET-1蛋白表達水平呈明顯的正相關(r=0.580,P<0.01)。(3)ET-1促進H9c2細胞分泌PDGF-B,并表現(xiàn)出濃度和時間依賴性。SIZ可減輕上述效應。

    結論: ET-1在房顫的發(fā)生中起著重要作用,其可能通過調控PDGF-B促進心房纖維化而導致房顫的發(fā)生。

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