細胞外囊泡與衰老的關(guān)系及其在骨代謝疾病中的研究進展

吳曉戀 吳珺華

同濟大學附屬口腔醫(yī)院，上海 200000

衰老是機體細胞、組織和器官等的結(jié)構(gòu)和功能隨著年齡的增長所發(fā)生的自然退化過程，是生命過程中的一種自然現(xiàn)象。隨著人口老齡化的加速，以骨質(zhì)疏松為代表的骨代謝性疾病在我國呈上升趨勢，且發(fā)病率隨年齡增長而上升。研究發(fā)現(xiàn)，衰老的細胞不僅會破壞組織的自我修復能力，還會分泌大量的生物活性分子，形成衰老相關(guān)分泌表型(senescent-associated secrete phenotype, SASP)，來影響周圍細胞的正常生理功能[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，清除衰老細胞或抑制衰老細胞SASP分泌可起到防止骨量丟失、減輕動脈粥樣硬化、提高胰島素的敏感性、改善心血管功能等作用[2]。

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，由細胞分泌產(chǎn)生，分子直徑在4 000 nm內(nèi)，包括外泌體、微囊泡及凋亡小體等[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，衰老細胞分泌的細胞外囊泡具有同SASP相似的功能，可調(diào)節(jié)靶細胞的表型，如加速細胞衰老的進程、促進炎癥的發(fā)生、抑制骨細胞分化、促進腫瘤形成等[4-7]。接下來，我們將總結(jié)近年來機體或細胞在衰老時分泌的細胞外囊泡與SASP因子之間關(guān)系的研究進展，并展望未來治療衰老引起的骨代謝性疾病研究中細胞外囊泡存在的潛在價值。

1 細胞衰老及衰老相關(guān)分泌表型

細胞衰老的特點是細胞生長抑制和增殖潛能衰竭，在細胞的表型、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)生了不可逆的改變。衰老細胞會分泌大量的炎癥因子和胞外基質(zhì)降解蛋白，在其周圍形成衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，誘導周圍組織出現(xiàn)連鎖反饋[8]。在不同刺激引起的細胞衰老模型中，SASP普遍存在且種類繁多，主要包含生長因子、趨化因子、促炎細胞因子、胞外蛋白酶和不可溶蛋白等。SASP在體內(nèi)的作用取決于其所處環(huán)境，可對機體產(chǎn)生有益或有害影響：SASP一方面可促進胚胎發(fā)育及組織修復，招募并激活免疫細胞，抑制腫瘤發(fā)展，另一方面可引起慢性炎癥，促進腫瘤的生長和侵襲等。

2 細胞外囊泡在細胞間物質(zhì)、信息傳遞過程中的作用

細胞外囊泡可通過轉(zhuǎn)運其攜帶的大量生物活性物質(zhì)，廣泛參與細胞間的物質(zhì)和信息傳遞。早在1996年研究人員就在B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)了外泌體，并發(fā)現(xiàn)這些外泌體具有刺激T細胞增殖、抑制腫瘤生長等生物活性作用[9]。在2007年，Valadi等[10]發(fā)現(xiàn)外泌體能在細胞間傳遞各種RNAs，如miRNAs、lncRNAs和mRNAs等，這是細胞外囊泡研究的一大突破。到2010年，有三個研究團隊相繼發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡內(nèi)的miRNAs可通過旁分泌的方式作用于相鄰的細胞，從而改變周圍細胞的功能[11-13]。隨后，對細胞外囊泡的研究進入另外一個新的階段，即研究細胞外囊泡介導的細胞間信息傳遞在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

目前Vesiclepedia中記錄了來自33種不同種類的538份研究，統(tǒng)計分析出細胞外囊泡中含有92 897種蛋白、27 642種mRNAs、4 934種miRNAs和584種脂質(zhì)[14]。細胞外囊泡傳遞的這些生物活性物質(zhì)能夠在生理或病理狀態(tài)下改變靶細胞的生物表型。有研究報道稱，生理狀態(tài)下分泌的細胞外囊泡有促進凝血的功能，同時還能作為旁分泌信使，參與體內(nèi)免疫平衡的調(diào)節(jié)[15]。相反，病理狀態(tài)下分泌的細胞外囊泡，如腫瘤細胞來源的細胞外囊泡具有促進血管再生、激活成纖維細胞、形成轉(zhuǎn)移前壁龕、促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、破壞血腦屏障等病理作用[16-19]。

3 衰老細胞來源胞外囊泡

研究發(fā)現(xiàn)，當細胞受到如氧化應(yīng)激、溫度變化、輻射等外界刺激時，細胞衰老速度加快，細胞外囊泡的分泌量也明顯增加，同時衰老細胞來源胞外囊泡的內(nèi)容物也會發(fā)生顯著變化[20]。Lehmann等[21]從前列腺癌患者體內(nèi)獲取癌細胞及纖維母細胞，經(jīng)放射誘導衰老后發(fā)現(xiàn)，細胞外囊泡釋放量明顯增加。另外，有學者從衰老的視網(wǎng)膜色素上皮組織中檢測到外泌體表面特異性蛋白CD63和LAMP2的表達量均呈急劇上升趨勢[22]。Takasugi等[6]利用人正常二倍體纖維細胞進一步證明了細胞在衰老過程中胞外囊泡的釋放量確實有明顯增加。他們的進一步研究還發(fā)現(xiàn)，利用阿霉素破壞細胞DNA，誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞衰老，在衰老過程中細胞外囊泡的分泌量也有明顯升高?？偟膩碚f，衰老過程中細胞外囊泡分泌量均有明顯增加，且增加量的多少與細胞類型、細胞衰老的誘導方式有關(guān)。

目前，衰老細胞胞外囊泡分泌量增加的機制仍未完全研究清楚。研究者推測其中一條可能的信號通路是p53介導的腫瘤抑制-激活信號通路6(TSAP6)，p53轉(zhuǎn)錄的靶基因直接作用于此通路。一項關(guān)于外泌體生物來源的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的產(chǎn)生依賴于Tp53的水平，并且由TSAP6和CHMP4C(p53轉(zhuǎn)錄的另一個靶基因)激活[23]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Tsap6基因的細胞，外泌體的分泌嚴重受到影響[24]。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，衰老細胞中在p53蛋白功能喪失之后，細胞周圍很明顯地形成了一種SASP的微環(huán)境[25]。這更進一步地證實了細胞外囊泡與SASP之間有著密切的聯(lián)系。

圖1 衰老細胞來源SASP、EVs及其作用圖注：衰老細胞來源的細胞外囊泡有與SASP相似的功能，同時也具有不同于SASP的生理或病理作用。Fig.1 SASP and Evs in cell senescence and the function

4 細胞外囊泡與細胞衰老

在衰老過程中，SASP因子如IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子等均會升高，而這些因子與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如炎癥、代謝類疾病等[26]，有研究發(fā)現(xiàn)人血清中IL-6會隨著年齡的增長而增多，并且很可能與老年人的死亡率有關(guān)[27]。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)血液中有些SASP因子會隨著年齡的增加而升高，但血液中衰老細胞來源胞外囊泡含量是否也隨著年齡的增加而升高仍未研究清楚。但是，在一些衰老相關(guān)性疾病，如慢性阻塞性肺炎中，研究發(fā)現(xiàn)血液中的胞外囊泡濃度確實有所升高[28]。另外，Machida等[29]分別收集了年輕人(平均年齡21歲)和老年人(平均年齡66歲)的唾液，并分離提取唾液中的外泌體，檢測出外泌體內(nèi)包含有242種miRNAs，篩選出其中的6種miRNAs進行深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p在年輕組及衰老組外泌體內(nèi)表達差異具有統(tǒng)計學意義，認為miR-24-3p是衰老的標志物之一。對腦組織內(nèi)外泌體的研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦干細胞會分泌出外泌體到腦脊液中，隨著年齡的增加，這些外泌體內(nèi)的miRNA表達量減少，而來自健康下丘腦干細胞分泌的外泌體則能夠減緩衰老的進程，簡言之，機體衰老的速度基本上是由下丘腦干細胞所控制的，而該過程一部分是下丘腦干細胞通過分泌外泌體來實現(xiàn)的[30]。

5 細胞外囊泡與骨代謝

骨吸收和形成的協(xié)調(diào)循環(huán)維持著骨代謝平衡，細胞外囊泡可介導成骨微環(huán)境中細胞間的通訊交流及骨重建機制。最新研究發(fā)現(xiàn)，成熟的破骨細胞可分泌含有RANK的細胞外囊泡，從成熟破骨細胞分泌的囊泡RANK，與成骨細胞RANKL結(jié)合并通過觸發(fā)RANKL反向信號傳導可促進骨形成，其激活的是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細胞衍生的semaphorin 4D抑制作用減弱后，成骨細胞中的RANKL反向信號傳導可以幫助成骨細胞以進一步成熟；此外，囊泡RANK分泌的時間與鞘氨醇-1-磷酸的時間相似，并且在破骨細胞中誘導Wnt10b，表明這些因子具有協(xié)同調(diào)節(jié)成骨細胞分化的作用[31]。間充質(zhì)干細胞(mesenchyma stem cell，MSCs)在骨量維持中起著重要作用，MSCs可向成骨分化、促進骨形成，但隨著增齡性的改變，其成骨分化能力也隨之減弱[32]。研究發(fā)現(xiàn)衰老細胞分泌的細胞外囊泡可導致MSCs的功能異常。近幾年有關(guān)細胞外囊泡與骨代謝的研究主要集中在外泌體在骨改建中的作用。

5.1 外泌體與成骨

Cui等[33]研究礦化成骨細胞分泌的外泌體發(fā)現(xiàn)，將成骨細胞分泌的外泌體與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchyma stem cell，BMSCs)共培養(yǎng)后，檢測到BMSCs細胞表面的成骨標志基因RUNX2和堿性磷酸酶顯著上調(diào)，基質(zhì)礦化增強，表明成骨細胞來源的外泌體能明顯促進BMSCs的成骨分化。人單核細胞分泌的外泌體對BMSCs也具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSCs共培養(yǎng)后，其細胞表面的成骨標志基因RUNX2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達與對照組相比顯著增加，而骨鈣素的表達無明顯差異[34]。人樹突狀細胞來源的外泌體對BMSCs的成骨分化亦有顯著促進作用，經(jīng)其作用后的BMSCs堿性磷酸酶的活性增強，成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Runx2表達增加[35]。此外，研究顯示，牛奶來源的外泌體可促進人BMSCs的增殖及成骨分化，通過增強未成熟成骨細胞的特異性基因表達、加速后期分化轉(zhuǎn)型為骨細胞來促進骨形成，但同時出現(xiàn)礦化作用增強、基質(zhì)膠原蛋白合成及沉積減少，予以該類外泌體飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠脛骨小梁區(qū)骨細胞數(shù)量及編織骨組織形成增加，使骨組織更脆，這表明牛奶來源的外泌體可促進成骨作用，但同時損害骨基質(zhì)的形成。Xu等[36]發(fā)現(xiàn)人BMSCs在成骨分化的不同階段中，其分泌的外泌體miRNAs表達譜亦隨之改變，且Wnt通路信號分子的富集與成骨相關(guān)的外泌體miRNAs差異化分布同步，這表明BMSCs分泌的外泌體miRNAs可調(diào)控其成骨分化功能。

5.2 外泌體與破骨

Deng等[37]研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞來源的外泌體表達的RANK配體(RANKL)蛋白，能與破骨細胞前體細胞膜上的RANK蛋白靶向結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)RANKL-RANK信號通路，來促進破骨分化及骨吸收活性。Huynh等[38]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞前體細胞來源的外泌體能促進破骨生成，而成熟破骨細胞來源的外泌體卻能抑制破骨細胞的形成。成熟破骨細胞分泌的外泌體含有RANK，減少此類外泌體后，破骨細胞生成抑制可明顯得到緩解。此外，破骨細胞分泌的外泌體可通過其內(nèi)富含的miRNAs調(diào)控成骨細胞的活性及骨生成功能。Sun等[39]研究顯示，破骨細胞分泌的外泌體通過膜上ephrinA2配體和EphA2受體之間的相互作用特異性識別成骨細胞，外泌體miRNA-214靶向性轉(zhuǎn)移至成骨細胞內(nèi)從而抑制成骨，通過Rab27a干擾RNAs來抑制外泌體的分泌，可減輕卵巢切除誘導的骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)成骨細胞功能障礙。

6 骨代謝性疾病中細胞衰老、SASP、衰老源性胞外囊泡

骨細胞的衰老水平對骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)非常重要。Farr等[40]研究發(fā)現(xiàn)，當骨量丟失發(fā)生時，骨細胞是所有相關(guān)細胞中衰老最明顯、分泌SASP因子量最多的細胞。實驗分別選取6月齡和24月齡的老鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老齡組中衰老的成骨細胞與年輕組的成骨細胞相比較，SASP的分泌量明顯升高。Farr等[41]進一步研究發(fā)現(xiàn)清除衰老的骨細胞能顯著降低相關(guān)因子分泌，抑制破骨細胞的形成，從而起到緩解骨丟失的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)骨疾病的發(fā)生原因與干細胞的減少有著密切聯(lián)系，尤其是BMSCs，隨著年齡的增長，其成骨分化功能減弱[32]。有研究表明，衰老細胞分泌的微囊泡，被間充質(zhì)干細胞識別攝取后，囊泡內(nèi)所攜帶的miR-31可作用于靶基因Frizzled-3，抑制間充質(zhì)干細胞的成骨分化[7]。研究者還發(fā)現(xiàn)抑制囊泡內(nèi)半乳糖凝集素3(一種能促進BMSCs向成骨細胞分化的因子)的表達，衰老的BMSCs成骨分化能力減弱[42]。Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞來源的外泌體miRNA-214-3p可靶向進入成骨細胞中，抑制體外的成骨細胞活性并減少體內(nèi)的骨形成，靶向抑制該類外泌體miRNA-214-3p的表達，骨質(zhì)疏松的老齡小鼠體內(nèi)骨形成明顯增加。Qi等[44]將人誘導的多能干細胞的間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體(hiPSC-MSC-Exos)與去卵巢的骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs-OVX)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，hiPSC-MSC-Exos能夠有效刺激rBMSCs-OVX 的增殖和增強成骨分化，并且隨著外泌體濃度的增加，成骨分化效應(yīng)也隨之增加。

骨代謝中細胞衰老及衰老細胞分泌的SASP、細胞外囊泡之間的關(guān)系如圖2。

圖2 衰老細胞來源細胞外囊泡、SASP與骨代謝圖注：骨代謝中的成骨細胞、破骨細胞及BMSCs分泌的外泌體形成的微環(huán)境，可相互影響，共同調(diào)節(jié)骨代謝平衡；衰老細胞分泌的SASP可加快周圍細胞的衰老速度，從而抑制成骨或破骨分化，同時衰老細胞分泌的細胞外囊泡也可參與調(diào)節(jié)骨代謝平衡，文獻報道其可抑制BMSCs的成骨分化，但對成骨細胞及破骨細胞的具體作用及機制有待進一步研究。Fig.2 Extracellular vesicles, SASP, and bone metabolism in cell senescence

7 展望與小結(jié)

總結(jié)近幾年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衰老細胞來源胞外囊泡具有以下幾個特點：第一，細胞衰老可刺激細胞外囊泡的釋放，并且這些囊泡所攜帶的生物活性物質(zhì)也會發(fā)生改變；第二，衰老細胞來源胞外囊泡可通過改變其攜帶的蛋白質(zhì)和miRNAs，來促進細胞的衰老進程；第三，衰老細胞來源胞外囊泡可在病理或生理狀態(tài)下，根據(jù)來源細胞的不同，具有不同的作用；第四，p53可調(diào)節(jié)衰老細胞來源胞外囊泡的釋放。綜上，我們可以有理由推測衰老細胞來源胞外囊泡具有同SASP相似的功能。衰老細胞分泌胞外囊泡可能是為了彌補溶酶體和自噬功能的失調(diào)。衰老源性胞外囊泡可能還有著與SASP不同的其他作用，這有待進一步的研究。

在過去，骨量減少或骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的研究主要集中在刺激相關(guān)細胞功能上，但是對于細胞與細胞之間的通訊沒有很好的研究，而細胞外囊泡通過囊泡傳輸系統(tǒng)將不同的細胞相互關(guān)聯(lián)，進行物質(zhì)及信息的轉(zhuǎn)運及傳輸，從而調(diào)控相關(guān)細胞的增殖與分化。SASP及細胞外囊泡在骨代謝性疾病如骨質(zhì)疏松癥、內(nèi)分泌骨病中均發(fā)揮了很重要的作用，因此，研究清楚SASP及細胞外囊泡與細胞衰老間存在的關(guān)系，可為未來治療衰老引起的骨代謝性疾病提供一個新的研究方向，胞外囊泡有望成為骨量減少或骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的潛在治療靶點。