基于斑馬魚行為變化的水體突發(fā)汞污染生物預(yù)警技術(shù)研究

逯南南，孫韶華，宋武昌，杜娟娟，賈瑞寶

(1．山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東濟(jì)南250021;2．山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101)

基于斑馬魚行為變化的水體突發(fā)汞污染生物預(yù)警技術(shù)研究

逯南南1，孫韶華1，宋武昌1，杜娟娟2，賈瑞寶1

(1．山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東濟(jì)南250021;2．山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101)

針對突發(fā)水污染事件難以準(zhǔn)確預(yù)警的現(xiàn)狀，通過模擬水體突發(fā)汞污染事件，開展了以生物魚行為變化為基礎(chǔ)的水質(zhì)生物預(yù)警技術(shù)研究。以正常水體中斑馬魚的行為變化為基礎(chǔ)，采用高速攝像跟蹤技術(shù)，解析了突發(fā)汞污染(0．1 mg/L)水體中斑馬魚游動行為(游動速度、高度、轉(zhuǎn)彎次數(shù)、加速度)和通訊行為(平均距離、分散度)等行為指標(biāo)的變化，結(jié)果表明:綜合評價指標(biāo)水質(zhì)健康指數(shù)6 h內(nèi)無法預(yù)警，以游動高度作為水體突發(fā)汞污染事件的監(jiān)測預(yù)警指標(biāo)，可將預(yù)警時間縮短至3 h。

汞;突發(fā)水污染;斑馬魚;行為變化;生物預(yù)警技術(shù)

近年來水體突發(fā)污染事故頻發(fā)，嚴(yán)重威脅飲用水安全。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測因監(jiān)測頻率低、耗時長等問題難以滿足水質(zhì)預(yù)警要求，而水質(zhì)在線監(jiān)測技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于水源地、河流、污水處理廠等水質(zhì)的監(jiān)測，其中基于水體中污染物暴露下魚的行為變化的在線生物監(jiān)測技術(shù)是進(jìn)行水質(zhì)預(yù)警的一種有效手段［1-3］。Belding等首次利用對魚的呼吸行為的監(jiān)測實(shí)現(xiàn)了水中污染物的預(yù)警，之后對魚的運(yùn)動行為(游泳速度、綜合行為強(qiáng)度等)、逃避行為(浮頭行動、急速游動等)、通訊行為(平均距離、分散度等)等指標(biāo)的監(jiān)測被應(yīng)用于水質(zhì)的在線預(yù)警［4-6］。

汞是我國《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》中重點(diǎn)防控的重金屬之一，可以通過多種途徑進(jìn)入人體引起神經(jīng)毒性、腎臟毒性、生殖毒性、免疫毒性和胚胎發(fā)育毒性等多系統(tǒng)損傷。歷史上曾發(fā)生過多次水體汞污染突發(fā)事件，如20世紀(jì)50年代日本熊本縣的“水俁病”事件引發(fā)上百人死亡;20世紀(jì)80年代，由于化工企業(yè)含汞廢水偷排，我國松花江一些江段汞含量大幅超標(biāo);我國錦州灣五里河也曾發(fā)生嚴(yán)重的水體汞污染，河水汞含量超標(biāo)最高達(dá)400余倍［7］。汞及其化合物的環(huán)境行為以及其引發(fā)的生態(tài)環(huán)境和健康問題，一直備受人們的廣泛關(guān)注，大量的調(diào)查研究表明，國內(nèi)一些主要的河流、湖泊存在不同程度的汞污染［8-10］。因此，開展水體中突發(fā)汞污染生物預(yù)警技術(shù)研究，實(shí)現(xiàn)對突發(fā)污染事件的早期預(yù)報，可縮短應(yīng)急響應(yīng)時間，保障飲用水安全。

本文采用斑馬魚作為受試魚種，以無機(jī)汞為污染物，利用高速攝像跟蹤技術(shù)，通過對魚群游動行為和通訊行為等多項(xiàng)行為指標(biāo)的實(shí)時監(jiān)測，考察污染物對斑馬魚行為的毒性效應(yīng)和該技術(shù)對汞突發(fā)水污染的預(yù)警效果，為基于魚類行為學(xué)的生物預(yù)警技術(shù)在水質(zhì)突發(fā)污染事件中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和分析方法。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所用斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center)，本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖，養(yǎng)殖水溫為25℃ ±1℃，pH值為7．2～7．6，使用增氧泵持續(xù)曝氣，保證充足的溶解氧(近飽和水平)，光照黑暗比為10 h∶14 h，每天投喂1次，試驗(yàn)前24 h不喂食，選取體長3 cm±0．2 cm的魚進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)中所用藥品均為色譜純及以上。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

按照《水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測定》(GB/T 13267—91)中的要求進(jìn)行斑馬魚急性毒性試驗(yàn)。

1．2．2 汞污染水體斑馬魚行為變化監(jiān)測

采用流水式試驗(yàn)(流速為2 L/h)開展汞污染水體斑馬魚行為變化的研究。以氯化汞配制汞污染水體(濃度以Hg2+計)，養(yǎng)殖用水為對照組，使用水質(zhì)毒性生物監(jiān)測儀(由深圳水務(wù)集團(tuán)開天源自動化工程有限公司生產(chǎn))對斑馬魚行為變化進(jìn)行監(jiān)測，該監(jiān)測系統(tǒng)示意圖見圖1。5條監(jiān)測用斑馬魚被置于尺寸為400 mm×75 mm×300 mm(長×寬×高)長方體測試箱內(nèi)(材質(zhì)為亞克力)，前置的CCD攝像實(shí)時跟蹤記錄每條魚的行為變化，并通過運(yùn)動行為解析軟件計算斑馬魚的運(yùn)動行為參數(shù)(游動速度、高度、轉(zhuǎn)彎次數(shù)、加速度)和通訊行為參數(shù)(平均距離、分散度)［11］。為避免生物鐘對斑馬魚行為的影響，所有批次試驗(yàn)進(jìn)行時間均為上午9:00至下午3:00，同時通過溫控裝置保持進(jìn)水溫度恒定，排除水溫對斑馬魚行為的影響。

圖1 斑馬魚行為監(jiān)測系統(tǒng)示意圖Fig．1 Experimental setup for behavioral measurement of zebrafish

1．2．3 數(shù)據(jù)分析

本文利用統(tǒng)計軟件SPSS21．0進(jìn)行Probit模型線性回歸，計算得出各個作用時間下污染物對斑馬魚的半致死率LC50和95%的置信區(qū)間，并采用單因素方差分析法進(jìn)行試驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2．1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

通過斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)，獲取了Hg2+對斑馬魚不同暴露時間的半致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間，見表1。由表1可見，試驗(yàn)結(jié)果與黃毅、汪紅軍等的研究結(jié)果相似，其中黃毅［12］發(fā)現(xiàn)Hg2+對斑馬魚的LC50-24h為0．20 mg/L，汪紅軍等［13］研究表明Hg2+對斑馬魚的LC50-96h為0．14 mg/L，而本試驗(yàn)Hg2+對斑馬魚的LC50-48h為0．19 mg/L。本文定義LC50-48h為1個毒性單位(1 TU)，并選取亞致死濃度劑量0．1 mg/L(國標(biāo)限值的100倍，約0．5TU)進(jìn)行后續(xù)的汞突發(fā)污染的模擬試驗(yàn)。

表1 斑馬魚不同暴露時間的半致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間Table 1 Hg2+concentrations causing 50%(LC50)of mortality on the tested zebrafish population after different time exposures with corresponding 95%confidence limits

2．2 汞污染水體斑馬魚行為變化

2．2．1 綜合評價指標(biāo)

水質(zhì)健康指數(shù)是由多項(xiàng)行為參數(shù)的監(jiān)測數(shù)據(jù)計算得到的用于水質(zhì)安全判定的一項(xiàng)綜合評價指標(biāo)，其取值范圍為0～100，水質(zhì)健康指數(shù)為60以上時表示水質(zhì)正常，低于60時監(jiān)測系統(tǒng)則報警。本試驗(yàn)得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續(xù)暴露6 h，其水質(zhì)健康指數(shù)的變化情況見圖2。由圖2可見，根據(jù)監(jiān)測系統(tǒng)推薦的報警限值，本試驗(yàn)在0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續(xù)暴露6 h，其水質(zhì)健康指數(shù)與對照組相比變化不大，未發(fā)生報警。因此，需要對單項(xiàng)行為指標(biāo)進(jìn)行分析，以期找到對汞敏感性高的指標(biāo)，從而縮短對突發(fā)事件的報警時間。

圖2 汞污染水體中水質(zhì)健康指數(shù)的變化Fig．2 Changes of water quality index in Hg2+polluted waterbody

2．2．2 斑馬魚游動行為指標(biāo)

圖3 汞污染水體中斑馬魚運(yùn)動行為的變化Fig．3 Swimming activity changes of zebrafish under Hg2+exposure

表2 斑馬魚游動行為指標(biāo)的差異性分析Table 2 Summary of statistical comparisons with behavioral endpoints under Hg2+exposure

正常水體中斑馬魚的游動速度、高度、轉(zhuǎn)彎次數(shù)、加速度保持相對穩(wěn)定，本試驗(yàn)得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續(xù)暴露6 h，其運(yùn)動行為的變化情況見圖3和表2。由圖3和表2可見，本試驗(yàn)在0．1 mg/L的汞污染脅迫下，斑馬魚的游動速度經(jīng)歷了一個先增大后恢復(fù)再減小的過程，表現(xiàn)出明顯的行為調(diào)節(jié)反應(yīng)。暴露后短時間內(nèi)斑馬魚的游動速度增大，第1個小時內(nèi)試驗(yàn)組游動速度平均值為41．00 mm/s，高于對照組的38．07 mm/s，此為水生生物對環(huán)境壓力所表現(xiàn)的“回避行為”，是魚類感知到污染物后的第一反應(yīng)，其表現(xiàn)形式和維持時間長短受污染物的種類及濃度的影響，“回避行為”也被應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測和預(yù)警［14］;在暴露后的第2個小時，試驗(yàn)組斑馬魚的游動速度與對照組相差不大，從第3個小時開始試驗(yàn)組斑馬魚的游動速度逐漸減小，至暴露后的第5個小時試驗(yàn)組斑馬魚的游動速度顯著低于對照組［見圖(a)和表2］。在Hg2+污染水體中，斑馬魚更傾向于在水箱頂部游動，游動高度在持續(xù)暴露下有明顯增大的趨勢，整個試驗(yàn)中，對照組斑馬魚的每小時平均游動高度在94．96～132．62 mm之間，試驗(yàn)組斑馬魚從暴露后的第3個小時開始，游動高度增大到250 mm以上，與對照組相比差異顯著［見圖3(b)和表2］;斑馬魚轉(zhuǎn)彎次數(shù)的變化與游動速度基本保持一致，只是試驗(yàn)組與對照組斑馬魚的統(tǒng)計學(xué)差異出現(xiàn)在暴露后的第6個小時［見圖3(c)和表2］;而兩組魚的加速度變化無明顯的規(guī)律性［見圖3(d)和表2］，因此在后續(xù)的統(tǒng)計學(xué)分析中不再考慮此項(xiàng)指標(biāo)。

2．2．3 斑馬魚通訊行為指標(biāo)

Chew等［15］研究表明，正常水體中魚群的運(yùn)動軌跡分布整齊且有規(guī)律，當(dāng)環(huán)境改變時，魚群分布會發(fā)生變化，可作為監(jiān)測外界環(huán)境壓力的有效指標(biāo)。汞污染水體暴露中，斑馬魚感知到污染物存在后會有短暫的集群反應(yīng)，魚之間的平均距離和分散度有明顯減小的現(xiàn)象。本試驗(yàn)得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續(xù)暴露6 h，其通訊行為的變化情況見圖4。由圖4可見，在暴露的前3 h，試驗(yàn)組斑馬魚的平均距離和分散度與對照組相比顯著減小，3 h后逐漸恢復(fù)，與對照組相比無顯著性差異。

圖4 汞污染水體中斑馬魚通訊行為的變化Fig．4 Communication patterns of zebrafish under Hg2+exposure

3 結(jié)論與展望

(1)汞突發(fā)污染水體中，斑馬魚的游動速度短時間內(nèi)增大，至暴露后的第2個小時恢復(fù)到暴露前的水平，之后游動速度逐漸下降，整個變化趨勢符合環(huán)境壓力模型。

(2)利用綜合評價指標(biāo)水質(zhì)健康指數(shù)進(jìn)行水質(zhì)預(yù)警，0．1 mg/L汞污染水體中6 h內(nèi)未發(fā)生報警，而通過對斑馬魚游動行為和通訊行為等多項(xiàng)指標(biāo)的分析，選取游動高度作為汞污染后的斑馬魚行為異常指標(biāo)，可將預(yù)警時間縮短到3 h。

(3)探索不同種類污染物暴露下魚體更為靈敏的行為反應(yīng)信號，獲取精確的分析數(shù)據(jù)并優(yōu)化分析方法，在水質(zhì)突發(fā)污染的初期及時做出預(yù)警并實(shí)現(xiàn)污染物的初步定性將是未來工作的重點(diǎn)。

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Technology of Behavior-based Biological Warning of Sudden Mercury Pollution in Water

LU Nannan1，SUN Shaohua1，SONG Wuchang1，DU Juanjuan2，JIA Ruibao1
(1．Shandong Province City Water and Drainage Water Quality Monitoring Center，Jinan250021，China;2．School of Municipal and Environmental Engineering，Shandong Jianzhu University，Jinan250101，China)

In view of the present situation that early warining of sudden water pollution is difficult，this paper simulates sudden mercury pollution to conduct the research on biological early warning technology based on fish behavior．Based on the behavior changes of zebrafish in normal water，the paper captures and analyzes the swimming behaviors(swimming speed，swimming depth，turning frequency and accelerated speed)and fish school behaviors (average distance，dispersion)of zebrafish under 0．1mg/L mercury exposure by high-speed photography tracking technology．The results show that early warning of mercury pollution could not be identified in six hours by comprehensive evaluation index，namely，water quality health index．By taking the swimming height as the monitoring indicator for sudden mercury pollution of waterbody，early warning time could be shortened to three hours．

mercury;sudden water pollution;zebrafish;behavioral change;biological warning technology

X52;X17

ADOI:10．13578/j．cnki．issn．1671-1556．2016．05．011

1671-1556(2016)05-0069-04

賈瑞寶(1968—)，男，博士，研究員，主要從事飲用水安全保障領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)和工程應(yīng)用研究。E-mail:jiaruibao68@ 126．com

2016-03-11

2016-03-31

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CP019);國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX07404-003);直飲水科技惠民示范工程項(xiàng)目(2013GS370202)

逯南南(1984—)，女，碩士，工程師，主要從事飲用水安全保障方面的研究。E-mail:nanwang316@163．com