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    基于RNA- seq識別布魯菌酸調(diào)控候選基因

    2016-03-31 07:43:30劉倩宏劉星宇何玉華吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院吉林吉林30廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局廣東廣州50470
    中國獸醫(yī)雜志 2016年1期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組布魯菌

    劉倩宏,劉星宇,閆 峰,何玉華,魏 杰(.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林吉林30;.廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局,廣東廣州50470)

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    基于RNA- seq識別布魯菌酸調(diào)控候選基因

    劉倩宏1,劉星宇2,閆峰1,何玉華1,魏杰1
    (1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林吉林132101;2.廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局,廣東廣州510470)

    摘要:布魯菌作為胞內(nèi)寄生菌,在胞內(nèi)生存面臨很多壓力。特別是感染早期,胞內(nèi)的酸化是布魯菌生存的必要條件。本試驗利用RNA-seq,對正常培養(yǎng)條件、酸性培養(yǎng)條件的布魯菌進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明,在酸性條件下113個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化(|log2Ratio|≥3),其中44%表達(dá)上調(diào)。經(jīng)pathway分析,差異基因分布在51個通路,其中與布魯菌胞內(nèi)生存及毒力相關(guān)的通路有6個,分別是氧化磷酸化、離子轉(zhuǎn)運、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)、二元轉(zhuǎn)運調(diào)控系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。布魯菌對于酸性生存環(huán)境表現(xiàn)多通路、多基因的適應(yīng)性變化,該研究為系統(tǒng)掌握酸調(diào)節(jié)基因奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:布魯菌;轉(zhuǎn)錄組;RNA-seq;酸壓力

    布魯菌病作為人獸共患病能引起野生動物、家畜和人類的感染。布魯菌作為胞內(nèi)寄生菌,面臨著一系列的生存壓力,比如營養(yǎng)缺乏、低滲透壓、強(qiáng)氧化、低pH值等。特別是在感染的早期,酸性生存環(huán)境對布魯菌的生存至關(guān)重要[1]。

    目前已經(jīng)認(rèn)識的對酸性生存環(huán)境進(jìn)行調(diào)控的基因及系統(tǒng)主要有IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)、GAD系統(tǒng)(The glutamic acid decarboxylase,GAD)、Asp24蛋白、HdeA蛋白、脲酶及二元調(diào)控系統(tǒng)。布魯菌在感染后被宿主的吞噬細(xì)胞吞噬,形成吞噬小體(Brucella-containing vacuole,BCV),BCV一直處于酸化環(huán)境。GAD系統(tǒng)在布魯菌對抗酸化環(huán)境(pH值2.5)和小鼠口服感染布魯菌的過程中都發(fā)揮作用。Asp24蛋白(24-kDa protein)由于在pH值4.0的環(huán)境下及感染的前3 h內(nèi)(pH值在3.8至7.3之間變化)獲得優(yōu)勢表達(dá),表明該蛋白在對抗酸化環(huán)境中也發(fā)揮重要作用[2]。布魯菌的脲酶由兩個獨立的基因群ure1和ure2構(gòu)成。有研究表明,ure2在對抗酸性環(huán)境中發(fā)揮作用[3]。二元調(diào)控系統(tǒng)由轉(zhuǎn)錄反應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子兩部分組成,有研究表明,布魯菌的mucR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在對抗酸性壓力及發(fā)揮毒力方面都發(fā)揮作用。HdeA作為周質(zhì)間隙蛋白,在低pH值條件下發(fā)揮作用,在大腸桿菌和志賀菌中都已得到證實。但究竟有多少基因參與到對酸性生存環(huán)境的調(diào)控中來,至今還缺乏全面系統(tǒng)掌握。

    本研究利用RNA-seq對羊型布魯菌16 M株在酸性培養(yǎng)環(huán)境及正常培養(yǎng)環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化進(jìn)行了比較、分析,識別顯著差異/富集的基因及通路,進(jìn)一步豐富對于參與酸性調(diào)控基因的認(rèn)識,為酸性調(diào)控基因的識別及繪制布魯菌酸性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1所用菌株及培養(yǎng)條件將羊型布魯菌16M株在胰酶大豆瓊脂平板(TSA)上劃線分離,于37℃5%CO2氣體下培養(yǎng)3~4 d,挑取單菌落到胰酶大豆液體培養(yǎng)基(TSB)內(nèi)增值到對數(shù)生長期,4℃保存?zhèn)溆谩0?∶100稀釋比例將母液導(dǎo)入到新鮮的TSB培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)至對數(shù)生長期,對菌液進(jìn)行菌落計數(shù)。取0.5 mL菌液用pH值4.5的TSB洗滌1次,并重懸與等體積的pH值4.5的TSB混合,置于37℃孵育4 h。所有活菌操作均在吉林大學(xué)生物安全實驗室完成。

    1.2RNA提取將16M菌株培養(yǎng)于pH值7.0 TSB培養(yǎng)基,試驗組菌株培養(yǎng)于pH值4.5 TSB培養(yǎng)基,其余培養(yǎng)條件相同。在試驗條件下刺激4 h后,分別提取試驗組(T group)、對照組(C group)細(xì)菌總RNA。提取RNA濃度、純度用分光光度計檢測合格后,送深圳華大基因公司測序。

    1.3RNA-seq技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA后,去除rRNA后,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。將mRNA隨機(jī)打斷成短片段,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA,然后合成二鏈cDNA,純化回收,構(gòu)建測序用文庫。文庫檢測合格后,Illumina HiSeqTM2000測序儀測序。測序所得的數(shù)據(jù)稱為總標(biāo)簽(raw reads/ raw data),對raw reads進(jìn)行過濾得到凈標(biāo)簽(clean reads)。clean reads質(zhì)控檢測合格后,進(jìn)行基因表達(dá)、注釋、及后續(xù)分析,并篩選出樣品間差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析。

    1.4熒光定量RT-PCR用熒光定量試驗進(jìn)行驗證部分測序結(jié)果。選取與布魯菌胞內(nèi)生存及毒力相關(guān)通路中的25個顯著差異基因進(jìn)行驗證。T組、C組總RNA提取操作同上。具體操作根據(jù)熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL,擴(kuò)增條件如下:95℃10 min,95℃15 s,45個循環(huán),60℃或58℃30 s,最后72℃30 s。反應(yīng)在ABI公司stepone plus系統(tǒng)運行,16s rRNA作為內(nèi)參,利用2-ΔΔct值計算不同基因相對轉(zhuǎn)錄水平。試驗重復(fù)3次,試驗所用引物略1。

    2 結(jié)果

    C組和T組分別獲得了6886380和6697942個總標(biāo)簽(raw reads/raw data)。經(jīng)比對,在C組與T組間共獲得1 250個差異表達(dá)基因(FDR≤0.001 and |log2Ratio|≥1)。其中,457個基因表達(dá)上調(diào),793個基因表達(dá)下調(diào)。在這1 250個基因中顯著差異的基因(|log2Ratio|≥3)有113個,其中50個基因上調(diào),63個基因下調(diào)(結(jié)果略)。

    2.1GO term顯著性富集分析通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。在所處的細(xì)胞位置本體中,核糖體和核糖核蛋白復(fù)合體是顯著富集的GO term(pvalue≤0.05);在所處的基因分子功能本體中,核糖體的結(jié)構(gòu)成分、RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性是顯著富集的GO term(p-value≤0.05);在所處的參與生物過程本體中,細(xì)胞大分子生物合成是顯著富集的GO term(p-value≤0.05)。

    2.2pathway顯著性富集分析在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,基于通路(pathway)的顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),51個pathways表現(xiàn)顯著性富集,其中核糖體和光合作用兩個通路的變化最顯著(Q-value≤0.05)。經(jīng)分析,有6個pathways、33個基因與布魯菌毒力及胞內(nèi)生存緊密相關(guān),具體見表1。

    在氧化磷酸化通路中有6個基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化,并且全部下調(diào)(圖1)。BMEII0248,BMEI0249,BMEI0250和BMEI0251四個基因在序列上緊密連接,并且BMEI0251基因還同時出現(xiàn)在細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞(bacterial invasion of epithelial cells)通路和光合作用和肽聚糖生物合成通路中;BMEI1545和BMEII0248基因也重復(fù)出現(xiàn)在光合作用通路中。在離子轉(zhuǎn)運通路中有3個基因的表達(dá)發(fā)生顯著差異,只有BMEII0704(編碼產(chǎn)物是細(xì)菌鐵蛋白)基因下調(diào)(表1)。在ABC轉(zhuǎn)運通路中有3個基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,BMEII0607基因上調(diào)。在分泌系統(tǒng)通路中有8個基因的表達(dá)發(fā)生了顯著差異(llog2Ratio|≥3),并且表達(dá)下調(diào)(表1)。在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路中有9個基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化,除了BMEI1026、BMEI0454和BMEII0036基因的表達(dá)上調(diào)外,其余5個基因全部下調(diào)(表1)。在二元調(diào)控系統(tǒng)通路中有4個基因的表達(dá)發(fā)生顯著差異,BMEI1596和BMEI1646基因表達(dá)上調(diào)(表1)。

    表1 與布魯菌毒力及胞內(nèi)生存相關(guān)的顯著變化基因及所處通路

    2.3熒光定量PCR結(jié)果

    為了驗證RNA-seq測序結(jié)果,隨機(jī)選取25個基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR試驗。結(jié)果表明,18個基因的表達(dá)趨勢出現(xiàn)了一致的結(jié)果,兩種技術(shù)的相符率達(dá)到72%(圖1)。

    3 討論

    布魯菌分泌系統(tǒng)中,virB2,virB3,virB4,virB5,virB6,virB8,virB9,virB10和virB11對于流產(chǎn)布魯菌在小鼠體內(nèi)發(fā)揮毒力是必需的。資料表明,virB12在感染期間能夠持續(xù)表達(dá),但在本研究中virB12基因的表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。T4SS中的8個基因都表現(xiàn)下調(diào)(表1),這些基因在布魯菌的胞內(nèi)生存的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用。金屬離子在構(gòu)成蛋白和細(xì)胞成分上發(fā)揮重要作用,同時對細(xì)胞代謝和細(xì)菌生理提供微量營養(yǎng)[4]。本研究中,BMEII0704基因(編碼產(chǎn)物是細(xì)菌鐵蛋白)顯著下調(diào),可能對細(xì)菌鐵蛋白合成產(chǎn)生影響,這可能是對酸性生存環(huán)境做出的適應(yīng)。BMEI0668基因(被命名為Asp24,其編碼產(chǎn)物是鈣聯(lián)蛋白)表達(dá)顯著上調(diào),這可能是對酸性生存環(huán)境的一種代償性對抗,這與Fichat A等人的報道相符[2]。鈣聯(lián)蛋白在細(xì)胞功能發(fā)揮及信號傳導(dǎo)等方面廣泛發(fā)揮作用。

    ABC轉(zhuǎn)運子編碼abcEDCBA或轉(zhuǎn)運亞基,轉(zhuǎn)運亞基在T4SS表達(dá)和避免與溶酶體接觸上發(fā)揮重要作用[5]。ABC轉(zhuǎn)運子的ATP酶被失活后,布魯菌S2308株的毒力顯著下降。ABC轉(zhuǎn)運子通路中的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化,這可能是受酸性生存環(huán)境的調(diào)節(jié),也可能在布魯菌的胞內(nèi)生存及毒力上發(fā)揮作用。氧化磷酸化能滿足布魯菌的能量需要,在營養(yǎng)缺乏的條件下,布魯菌要降低自身的代謝水平以適應(yīng)自己所處的壓力環(huán)境。在本研究中,氧化磷酸化通路中所有基因都下調(diào),這可能是細(xì)菌降低了自己的能量代謝水平以適應(yīng)生存的酸性環(huán)境。

    圖1 熒光定量RT- PCR與RNA- seq結(jié)果比較

    布魯菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是毒力因子,還緊密調(diào)節(jié)一些編碼金屬輸入、輸出及存儲系統(tǒng)功能基因的表達(dá)。MarR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子可以通過調(diào)節(jié)virB啟動子來控制毒力,GntR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在感染細(xì)胞內(nèi)對毒力調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用。熱激蛋白作為分子伴侶能保護(hù)細(xì)菌對抗細(xì)胞的壓力,比如熱激等,在蛋白的折疊及轉(zhuǎn)運方面也廣泛發(fā)揮作用。布魯菌的HSPs同時還具有良好免疫原性,被廣泛用作基因工程疫苗及保護(hù)性抗原的研究。布魯菌的外膜蛋白由于具有良好的抗原特性及高度的保守性也被廣泛用作疫苗候選者及診斷性抗原的研究。布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌的毒力、胞內(nèi)生存及對抗壓力等方面發(fā)揮重要作用,F(xiàn)euP/FeuQ、BvrS/BvrR、NtrB/NtrC、NtrX/Ntr Y、LOV-HK、CenR、PrlS/PrlR及MucR等二元調(diào)控系統(tǒng)已被廣泛報道,但在本研究中這些二元調(diào)控系統(tǒng)的基因沒有發(fā)生顯著變化。

    本研究通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,識別113個在酸性生存環(huán)境中發(fā)生顯著表達(dá)的基因,并對這些顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO term及pathway分析。結(jié)果表明,布魯菌在胞內(nèi)寄生,不是某個基因、而是多個基因相互作用構(gòu)成一個有機(jī)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)在發(fā)揮作用,該菌對酸性生存環(huán)境表現(xiàn)出多系統(tǒng)、多基因的變化及適應(yīng)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] F Porte,Liautard J P . Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages[J].Infect Immun,1999,67(8):p.4041-4047.

    [2] Lin J,Tomas Ficht.Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection[J] . Infect Immun,1995,63(4):p. 1409-1414.

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    [5] Silva T M.The predicted ABC transporter AbcEDCBA is required for type IV secretion system expression and lysosomal evasion by Brucella ovis[J].PLoS One,2014,9(12):p.e114532.

    Identifying Candidate Genes of Acid Regulation Genes of BrucellaBased on RNA- seq

    LIU Qian-hong1,LIU Xing-yu2,YAN Feng1,HE Yu-hua1,WEI Jie1
    (1.Jilin Agricultural Science and Technology University,Jilin 132101,China;2.Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection and Quarantine Brueau of P.R.C,Guangzhou 510470,China)

    Abstract:Brucella melitensis,a facultative bacteria,encounters a very stressful environment in phagosomes,especially at low pH levels.In our study,comparative transcriptomes with RNA-seq were used to analyze the changes of genes in normal-medium culture and in pH4.4-medium culture.The results revealed that 113 genes expressed with significant differences(|log2Ratio|≥3),and about 44%genes expressed as up-regulated .These genes distributed in 51 pathways,in which ribosome and photosynthesis pathways were significantly enriched .Six pathways(oxidative phosphorylation,iron-transporting,bacterial secretion system,transcriptional regulation,two-component system,and ABC transporters pathways)tightly related to the intracellular survival and virulence of Brucella were analyzed. Global changes involved in many pathways and genes were adapted to the acidic environment of Brucella.

    Key words:Brucella melitensis;comparative transcriptomes;RNA-seq;acid strss

    作者簡介:劉倩宏(1973-),女,副教授,博士,從事布魯菌病的相關(guān)研究,E-mail:qianhongliu@126.com

    基金項目:吉林省科技廳項目(20130101113JC);吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項目(X906)

    收稿日期:2015-11-26

    中圖分類號:S852.61

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:0529- 6005(2016)01- 0034- 04

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