• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于RNA- seq識別布魯菌酸調(diào)控候選基因

    2016-03-31 07:43:30劉倩宏劉星宇何玉華吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院吉林吉林30廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局廣東廣州50470
    中國獸醫(yī)雜志 2016年1期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組布魯菌

    劉倩宏,劉星宇,閆 峰,何玉華,魏 杰(.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林吉林30;.廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局,廣東廣州50470)

    ?

    基于RNA- seq識別布魯菌酸調(diào)控候選基因

    劉倩宏1,劉星宇2,閆峰1,何玉華1,魏杰1
    (1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林吉林132101;2.廣州白云機(jī)場出入境檢驗檢疫局,廣東廣州510470)

    摘要:布魯菌作為胞內(nèi)寄生菌,在胞內(nèi)生存面臨很多壓力。特別是感染早期,胞內(nèi)的酸化是布魯菌生存的必要條件。本試驗利用RNA-seq,對正常培養(yǎng)條件、酸性培養(yǎng)條件的布魯菌進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明,在酸性條件下113個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化(|log2Ratio|≥3),其中44%表達(dá)上調(diào)。經(jīng)pathway分析,差異基因分布在51個通路,其中與布魯菌胞內(nèi)生存及毒力相關(guān)的通路有6個,分別是氧化磷酸化、離子轉(zhuǎn)運、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)、二元轉(zhuǎn)運調(diào)控系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。布魯菌對于酸性生存環(huán)境表現(xiàn)多通路、多基因的適應(yīng)性變化,該研究為系統(tǒng)掌握酸調(diào)節(jié)基因奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:布魯菌;轉(zhuǎn)錄組;RNA-seq;酸壓力

    布魯菌病作為人獸共患病能引起野生動物、家畜和人類的感染。布魯菌作為胞內(nèi)寄生菌,面臨著一系列的生存壓力,比如營養(yǎng)缺乏、低滲透壓、強(qiáng)氧化、低pH值等。特別是在感染的早期,酸性生存環(huán)境對布魯菌的生存至關(guān)重要[1]。

    目前已經(jīng)認(rèn)識的對酸性生存環(huán)境進(jìn)行調(diào)控的基因及系統(tǒng)主要有IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)、GAD系統(tǒng)(The glutamic acid decarboxylase,GAD)、Asp24蛋白、HdeA蛋白、脲酶及二元調(diào)控系統(tǒng)。布魯菌在感染后被宿主的吞噬細(xì)胞吞噬,形成吞噬小體(Brucella-containing vacuole,BCV),BCV一直處于酸化環(huán)境。GAD系統(tǒng)在布魯菌對抗酸化環(huán)境(pH值2.5)和小鼠口服感染布魯菌的過程中都發(fā)揮作用。Asp24蛋白(24-kDa protein)由于在pH值4.0的環(huán)境下及感染的前3 h內(nèi)(pH值在3.8至7.3之間變化)獲得優(yōu)勢表達(dá),表明該蛋白在對抗酸化環(huán)境中也發(fā)揮重要作用[2]。布魯菌的脲酶由兩個獨立的基因群ure1和ure2構(gòu)成。有研究表明,ure2在對抗酸性環(huán)境中發(fā)揮作用[3]。二元調(diào)控系統(tǒng)由轉(zhuǎn)錄反應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子兩部分組成,有研究表明,布魯菌的mucR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在對抗酸性壓力及發(fā)揮毒力方面都發(fā)揮作用。HdeA作為周質(zhì)間隙蛋白,在低pH值條件下發(fā)揮作用,在大腸桿菌和志賀菌中都已得到證實。但究竟有多少基因參與到對酸性生存環(huán)境的調(diào)控中來,至今還缺乏全面系統(tǒng)掌握。

    本研究利用RNA-seq對羊型布魯菌16 M株在酸性培養(yǎng)環(huán)境及正常培養(yǎng)環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化進(jìn)行了比較、分析,識別顯著差異/富集的基因及通路,進(jìn)一步豐富對于參與酸性調(diào)控基因的認(rèn)識,為酸性調(diào)控基因的識別及繪制布魯菌酸性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1所用菌株及培養(yǎng)條件將羊型布魯菌16M株在胰酶大豆瓊脂平板(TSA)上劃線分離,于37℃5%CO2氣體下培養(yǎng)3~4 d,挑取單菌落到胰酶大豆液體培養(yǎng)基(TSB)內(nèi)增值到對數(shù)生長期,4℃保存?zhèn)溆谩0?∶100稀釋比例將母液導(dǎo)入到新鮮的TSB培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)至對數(shù)生長期,對菌液進(jìn)行菌落計數(shù)。取0.5 mL菌液用pH值4.5的TSB洗滌1次,并重懸與等體積的pH值4.5的TSB混合,置于37℃孵育4 h。所有活菌操作均在吉林大學(xué)生物安全實驗室完成。

    1.2RNA提取將16M菌株培養(yǎng)于pH值7.0 TSB培養(yǎng)基,試驗組菌株培養(yǎng)于pH值4.5 TSB培養(yǎng)基,其余培養(yǎng)條件相同。在試驗條件下刺激4 h后,分別提取試驗組(T group)、對照組(C group)細(xì)菌總RNA。提取RNA濃度、純度用分光光度計檢測合格后,送深圳華大基因公司測序。

    1.3RNA-seq技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA后,去除rRNA后,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。將mRNA隨機(jī)打斷成短片段,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA,然后合成二鏈cDNA,純化回收,構(gòu)建測序用文庫。文庫檢測合格后,Illumina HiSeqTM2000測序儀測序。測序所得的數(shù)據(jù)稱為總標(biāo)簽(raw reads/ raw data),對raw reads進(jìn)行過濾得到凈標(biāo)簽(clean reads)。clean reads質(zhì)控檢測合格后,進(jìn)行基因表達(dá)、注釋、及后續(xù)分析,并篩選出樣品間差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析。

    1.4熒光定量RT-PCR用熒光定量試驗進(jìn)行驗證部分測序結(jié)果。選取與布魯菌胞內(nèi)生存及毒力相關(guān)通路中的25個顯著差異基因進(jìn)行驗證。T組、C組總RNA提取操作同上。具體操作根據(jù)熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL,擴(kuò)增條件如下:95℃10 min,95℃15 s,45個循環(huán),60℃或58℃30 s,最后72℃30 s。反應(yīng)在ABI公司stepone plus系統(tǒng)運行,16s rRNA作為內(nèi)參,利用2-ΔΔct值計算不同基因相對轉(zhuǎn)錄水平。試驗重復(fù)3次,試驗所用引物略1。

    2 結(jié)果

    C組和T組分別獲得了6886380和6697942個總標(biāo)簽(raw reads/raw data)。經(jīng)比對,在C組與T組間共獲得1 250個差異表達(dá)基因(FDR≤0.001 and |log2Ratio|≥1)。其中,457個基因表達(dá)上調(diào),793個基因表達(dá)下調(diào)。在這1 250個基因中顯著差異的基因(|log2Ratio|≥3)有113個,其中50個基因上調(diào),63個基因下調(diào)(結(jié)果略)。

    2.1GO term顯著性富集分析通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。在所處的細(xì)胞位置本體中,核糖體和核糖核蛋白復(fù)合體是顯著富集的GO term(pvalue≤0.05);在所處的基因分子功能本體中,核糖體的結(jié)構(gòu)成分、RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性是顯著富集的GO term(p-value≤0.05);在所處的參與生物過程本體中,細(xì)胞大分子生物合成是顯著富集的GO term(p-value≤0.05)。

    2.2pathway顯著性富集分析在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,基于通路(pathway)的顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),51個pathways表現(xiàn)顯著性富集,其中核糖體和光合作用兩個通路的變化最顯著(Q-value≤0.05)。經(jīng)分析,有6個pathways、33個基因與布魯菌毒力及胞內(nèi)生存緊密相關(guān),具體見表1。

    在氧化磷酸化通路中有6個基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化,并且全部下調(diào)(圖1)。BMEII0248,BMEI0249,BMEI0250和BMEI0251四個基因在序列上緊密連接,并且BMEI0251基因還同時出現(xiàn)在細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞(bacterial invasion of epithelial cells)通路和光合作用和肽聚糖生物合成通路中;BMEI1545和BMEII0248基因也重復(fù)出現(xiàn)在光合作用通路中。在離子轉(zhuǎn)運通路中有3個基因的表達(dá)發(fā)生顯著差異,只有BMEII0704(編碼產(chǎn)物是細(xì)菌鐵蛋白)基因下調(diào)(表1)。在ABC轉(zhuǎn)運通路中有3個基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,BMEII0607基因上調(diào)。在分泌系統(tǒng)通路中有8個基因的表達(dá)發(fā)生了顯著差異(llog2Ratio|≥3),并且表達(dá)下調(diào)(表1)。在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路中有9個基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化,除了BMEI1026、BMEI0454和BMEII0036基因的表達(dá)上調(diào)外,其余5個基因全部下調(diào)(表1)。在二元調(diào)控系統(tǒng)通路中有4個基因的表達(dá)發(fā)生顯著差異,BMEI1596和BMEI1646基因表達(dá)上調(diào)(表1)。

    表1 與布魯菌毒力及胞內(nèi)生存相關(guān)的顯著變化基因及所處通路

    2.3熒光定量PCR結(jié)果

    為了驗證RNA-seq測序結(jié)果,隨機(jī)選取25個基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR試驗。結(jié)果表明,18個基因的表達(dá)趨勢出現(xiàn)了一致的結(jié)果,兩種技術(shù)的相符率達(dá)到72%(圖1)。

    3 討論

    布魯菌分泌系統(tǒng)中,virB2,virB3,virB4,virB5,virB6,virB8,virB9,virB10和virB11對于流產(chǎn)布魯菌在小鼠體內(nèi)發(fā)揮毒力是必需的。資料表明,virB12在感染期間能夠持續(xù)表達(dá),但在本研究中virB12基因的表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。T4SS中的8個基因都表現(xiàn)下調(diào)(表1),這些基因在布魯菌的胞內(nèi)生存的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用。金屬離子在構(gòu)成蛋白和細(xì)胞成分上發(fā)揮重要作用,同時對細(xì)胞代謝和細(xì)菌生理提供微量營養(yǎng)[4]。本研究中,BMEII0704基因(編碼產(chǎn)物是細(xì)菌鐵蛋白)顯著下調(diào),可能對細(xì)菌鐵蛋白合成產(chǎn)生影響,這可能是對酸性生存環(huán)境做出的適應(yīng)。BMEI0668基因(被命名為Asp24,其編碼產(chǎn)物是鈣聯(lián)蛋白)表達(dá)顯著上調(diào),這可能是對酸性生存環(huán)境的一種代償性對抗,這與Fichat A等人的報道相符[2]。鈣聯(lián)蛋白在細(xì)胞功能發(fā)揮及信號傳導(dǎo)等方面廣泛發(fā)揮作用。

    ABC轉(zhuǎn)運子編碼abcEDCBA或轉(zhuǎn)運亞基,轉(zhuǎn)運亞基在T4SS表達(dá)和避免與溶酶體接觸上發(fā)揮重要作用[5]。ABC轉(zhuǎn)運子的ATP酶被失活后,布魯菌S2308株的毒力顯著下降。ABC轉(zhuǎn)運子通路中的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化,這可能是受酸性生存環(huán)境的調(diào)節(jié),也可能在布魯菌的胞內(nèi)生存及毒力上發(fā)揮作用。氧化磷酸化能滿足布魯菌的能量需要,在營養(yǎng)缺乏的條件下,布魯菌要降低自身的代謝水平以適應(yīng)自己所處的壓力環(huán)境。在本研究中,氧化磷酸化通路中所有基因都下調(diào),這可能是細(xì)菌降低了自己的能量代謝水平以適應(yīng)生存的酸性環(huán)境。

    圖1 熒光定量RT- PCR與RNA- seq結(jié)果比較

    布魯菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是毒力因子,還緊密調(diào)節(jié)一些編碼金屬輸入、輸出及存儲系統(tǒng)功能基因的表達(dá)。MarR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子可以通過調(diào)節(jié)virB啟動子來控制毒力,GntR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在感染細(xì)胞內(nèi)對毒力調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用。熱激蛋白作為分子伴侶能保護(hù)細(xì)菌對抗細(xì)胞的壓力,比如熱激等,在蛋白的折疊及轉(zhuǎn)運方面也廣泛發(fā)揮作用。布魯菌的HSPs同時還具有良好免疫原性,被廣泛用作基因工程疫苗及保護(hù)性抗原的研究。布魯菌的外膜蛋白由于具有良好的抗原特性及高度的保守性也被廣泛用作疫苗候選者及診斷性抗原的研究。布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌的毒力、胞內(nèi)生存及對抗壓力等方面發(fā)揮重要作用,F(xiàn)euP/FeuQ、BvrS/BvrR、NtrB/NtrC、NtrX/Ntr Y、LOV-HK、CenR、PrlS/PrlR及MucR等二元調(diào)控系統(tǒng)已被廣泛報道,但在本研究中這些二元調(diào)控系統(tǒng)的基因沒有發(fā)生顯著變化。

    本研究通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,識別113個在酸性生存環(huán)境中發(fā)生顯著表達(dá)的基因,并對這些顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO term及pathway分析。結(jié)果表明,布魯菌在胞內(nèi)寄生,不是某個基因、而是多個基因相互作用構(gòu)成一個有機(jī)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)在發(fā)揮作用,該菌對酸性生存環(huán)境表現(xiàn)出多系統(tǒng)、多基因的變化及適應(yīng)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] F Porte,Liautard J P . Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages[J].Infect Immun,1999,67(8):p.4041-4047.

    [2] Lin J,Tomas Ficht.Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection[J] . Infect Immun,1995,63(4):p. 1409-1414.

    [3] Sangari F J.Brucella abortus ure2 region contains an acid-activated urea transporter and a nickel transport system [J].BMC Microbiol,2010,10:p.107-112.

    [4] Waldron K J.Metalloproteins and metal sensing[J].Nature,2009,460(7257):823-830.

    [5] Silva T M.The predicted ABC transporter AbcEDCBA is required for type IV secretion system expression and lysosomal evasion by Brucella ovis[J].PLoS One,2014,9(12):p.e114532.

    Identifying Candidate Genes of Acid Regulation Genes of BrucellaBased on RNA- seq

    LIU Qian-hong1,LIU Xing-yu2,YAN Feng1,HE Yu-hua1,WEI Jie1
    (1.Jilin Agricultural Science and Technology University,Jilin 132101,China;2.Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection and Quarantine Brueau of P.R.C,Guangzhou 510470,China)

    Abstract:Brucella melitensis,a facultative bacteria,encounters a very stressful environment in phagosomes,especially at low pH levels.In our study,comparative transcriptomes with RNA-seq were used to analyze the changes of genes in normal-medium culture and in pH4.4-medium culture.The results revealed that 113 genes expressed with significant differences(|log2Ratio|≥3),and about 44%genes expressed as up-regulated .These genes distributed in 51 pathways,in which ribosome and photosynthesis pathways were significantly enriched .Six pathways(oxidative phosphorylation,iron-transporting,bacterial secretion system,transcriptional regulation,two-component system,and ABC transporters pathways)tightly related to the intracellular survival and virulence of Brucella were analyzed. Global changes involved in many pathways and genes were adapted to the acidic environment of Brucella.

    Key words:Brucella melitensis;comparative transcriptomes;RNA-seq;acid strss

    作者簡介:劉倩宏(1973-),女,副教授,博士,從事布魯菌病的相關(guān)研究,E-mail:qianhongliu@126.com

    基金項目:吉林省科技廳項目(20130101113JC);吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項目(X906)

    收稿日期:2015-11-26

    中圖分類號:S852.61

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:0529- 6005(2016)01- 0034- 04

    猜你喜歡
    轉(zhuǎn)錄組布魯菌
    廣西羊種布魯菌病菌株種型鑒定及評價
    基于轉(zhuǎn)錄組測序的山茱萸次生代謝生物合成相關(guān)基因的挖掘
    金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分析
    人參屬藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展
    布魯菌病的流行特點及防控措施
    布魯菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的構(gòu)建及毒力和免疫原性的評估
    大豆轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)展綜述
    兩種全自動微生物鑒定系統(tǒng)在布魯菌鑒定中的應(yīng)用比較
    丰满迷人的少妇在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级毛片我不卡| 成人黄色视频免费在线看| 免费在线观看完整版高清| 热re99久久精品国产66热6| 脱女人内裤的视频| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久精品人妻al黑| 自线自在国产av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲伊人久久精品综合| 在线看a的网站| 久久亚洲国产成人精品v| 飞空精品影院首页| 啦啦啦在线免费观看视频4| 七月丁香在线播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 老司机影院毛片| 欧美人与善性xxx| 少妇精品久久久久久久| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕色久视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩av久久| 国产1区2区3区精品| 国产一区二区 视频在线| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一级毛片 在线播放| 只有这里有精品99| 90打野战视频偷拍视频| 国产不卡av网站在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品免费视频内射| 色播在线永久视频| 国产精品 欧美亚洲| 一区二区av电影网| 亚洲一码二码三码区别大吗| 尾随美女入室| 亚洲欧美激情在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美97在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久中文字幕一级| 一区二区三区激情视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99精品久久久久人妻精品| 国产又爽黄色视频| 少妇粗大呻吟视频| 大片免费播放器 马上看| 国产成人免费观看mmmm| 国产有黄有色有爽视频| 九草在线视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 色播在线永久视频| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩大码丰满熟妇| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久精品精品| 欧美黄色淫秽网站| 午夜老司机福利片| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲五月婷婷丁香| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产亚洲精品第一综合不卡| 婷婷色av中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲国产最新在线播放| 精品一区在线观看国产| 在线av久久热| 99香蕉大伊视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人免费观看视频高清| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久网色| www日本在线高清视频| 一级毛片女人18水好多 | 久久女婷五月综合色啪小说| 啦啦啦 在线观看视频| 十八禁高潮呻吟视频| 一本久久精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 叶爱在线成人免费视频播放| 男女床上黄色一级片免费看| 黄色 视频免费看| 一级毛片女人18水好多 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 电影成人av| 一二三四社区在线视频社区8| 婷婷成人精品国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 桃花免费在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品一二三| 男人添女人高潮全过程视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 最黄视频免费看| 只有这里有精品99| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 黄色一级大片看看| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品国产区一区二| 一级a爱视频在线免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成人国产一区在线观看 | 日本欧美视频一区| 日韩视频在线欧美| 视频区欧美日本亚洲| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲成人国产一区在线观看 | 波多野结衣一区麻豆| 国产欧美日韩一区二区三 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黄色 视频免费看| 水蜜桃什么品种好| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲av片天天在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日韩av久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| www.熟女人妻精品国产| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美精品av麻豆av| 亚洲国产欧美在线一区| 一级毛片 在线播放| 只有这里有精品99| 超色免费av| 90打野战视频偷拍视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产视频一区二区在线看| 丝袜脚勾引网站| 国产视频一区二区在线看| 国产精品久久久久成人av| 美国免费a级毛片| 国产成人精品久久二区二区免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黄色一级大片看看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩视频在线欧美| videos熟女内射| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲,一卡二卡三卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久免费观看电影| 亚洲九九香蕉| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产av精品麻豆| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产成人精品久久二区二区91| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 久久影院123| 高清av免费在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 一区二区av电影网| 国产一区二区在线观看av| 午夜久久久在线观看| 精品久久久久久电影网| 一区二区三区精品91| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人免费观看视频高清| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久av网站| kizo精华| 国产在线观看jvid| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产在线观看jvid| 亚洲成人免费av在线播放| 超碰97精品在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 丝袜脚勾引网站| 9191精品国产免费久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩大片免费观看网站| 日韩伦理黄色片| 国产精品成人在线| 天堂中文最新版在线下载| 黄色视频不卡| 宅男免费午夜| 一个人免费看片子| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品国产区一区二| 老熟女久久久| 成年av动漫网址| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品国产av蜜桃| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老熟女久久久| 午夜视频精品福利| 亚洲伊人色综图| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女午夜视频在线观看| 国产在线观看jvid| 一区二区日韩欧美中文字幕| av在线老鸭窝| 亚洲人成网站在线观看播放| 黄片小视频在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产福利在线免费观看视频| 久久九九热精品免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人精品一二三区| 黑人猛操日本美女一级片| 色视频在线一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜日韩欧美国产| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美清纯卡通| a 毛片基地| 18禁观看日本| 欧美日韩亚洲高清精品| 嫩草影视91久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 九草在线视频观看| 久久鲁丝午夜福利片| 天天操日日干夜夜撸| 99热国产这里只有精品6| 搡老乐熟女国产| 欧美大码av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产福利在线免费观看视频| 99国产综合亚洲精品| 国产精品.久久久| www.999成人在线观看| 宅男免费午夜| 久久av网站| 欧美日本中文国产一区发布| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费在线观看黄色视频的| 精品国产乱码久久久久久男人| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩视频精品一区| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美国产精品一级二级三级| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜免费鲁丝| 男男h啪啪无遮挡| 久久国产精品影院| 99久久人妻综合| 波多野结衣av一区二区av| 日本五十路高清| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久精品国产a三级三级三级| 国产亚洲av高清不卡| 国产一级毛片在线| 黄色 视频免费看| 欧美日本中文国产一区发布| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人啪精品午夜网站| 99国产精品一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品国产av在线观看| 九草在线视频观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 91麻豆av在线| 中国国产av一级| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 曰老女人黄片| 黄色 视频免费看| tube8黄色片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 午夜激情久久久久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 精品国产国语对白av| a级毛片黄视频| 日本欧美视频一区| 黄色视频不卡| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品人妻久久久影院| 久久国产精品人妻蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲国产看品久久| 男女床上黄色一级片免费看| 久久精品亚洲av国产电影网| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人妻 亚洲 视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人精品无人区| 欧美日韩成人在线一区二区| 首页视频小说图片口味搜索 | 看免费av毛片| 亚洲av综合色区一区| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品二区激情视频| 最近中文字幕2019免费版| 99热网站在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 黄色 视频免费看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男人舔女人的私密视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美变态另类bdsm刘玥| 色网站视频免费| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 国产99久久九九免费精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲国产精品999| 欧美日韩综合久久久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲色图综合在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 丁香六月天网| 亚洲av美国av| 欧美精品一区二区免费开放| 大码成人一级视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 999久久久国产精品视频| 精品视频人人做人人爽| 黄色视频不卡| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲精品第二区| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 老司机影院毛片| 国产精品av久久久久免费| 丝袜人妻中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 无限看片的www在线观看| 午夜视频精品福利| 大陆偷拍与自拍| 国产成人91sexporn| 亚洲,一卡二卡三卡| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲中文av在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产片内射在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 美女高潮到喷水免费观看| 国产一区二区在线观看av| 高清不卡的av网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 黄色一级大片看看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美人与善性xxx| 伊人亚洲综合成人网| 欧美国产精品一级二级三级| 曰老女人黄片| 精品亚洲成a人片在线观看| avwww免费| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 777米奇影视久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 精品久久久久久久毛片微露脸 | 最近手机中文字幕大全| 我要看黄色一级片免费的| 日本91视频免费播放| 女性生殖器流出的白浆| 后天国语完整版免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费看不卡的av| 99精品久久久久人妻精品| 国产视频首页在线观看| 丝袜脚勾引网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩人妻精品一区2区三区| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 午夜av观看不卡| 波多野结衣一区麻豆| 久久ye,这里只有精品| 国产精品久久久久成人av| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲人成电影免费在线| 日日夜夜操网爽| 老汉色∧v一级毛片| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产片特级美女逼逼视频| 日本欧美视频一区| 亚洲av日韩在线播放| 午夜久久久在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 又紧又爽又黄一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区精品91| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 成人国产一区最新在线观看 | 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品在线美女| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | bbb黄色大片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 91字幕亚洲| 一级,二级,三级黄色视频| 999精品在线视频| 无限看片的www在线观看| 乱人伦中国视频| 国产成人精品在线电影| 国产片内射在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产xxxxx性猛交| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费在线观看日本一区| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 伊人亚洲综合成人网| 9色porny在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 色网站视频免费| 亚洲国产欧美在线一区| 免费在线观看影片大全网站 | 欧美日韩精品网址| 考比视频在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av美国av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久人人爽人人片av| 最新的欧美精品一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av片天天在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av美国av| 91老司机精品| 国产又爽黄色视频| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩av久久| 日本黄色日本黄色录像| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久九九热精品免费| 一二三四在线观看免费中文在| 女人久久www免费人成看片| 丁香六月欧美| 亚洲久久久国产精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产一区二区三区综合在线观看| av不卡在线播放| 十八禁人妻一区二区| 一级黄色大片毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 蜜桃国产av成人99| 国产精品成人在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美激情高清一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 啦啦啦在线免费观看视频4| 深夜精品福利| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产精品三级大全| 亚洲国产日韩一区二区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 不卡av一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 超碰97精品在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产欧美在线一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 91九色精品人成在线观看| 免费观看人在逋| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费看十八禁软件| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲伊人色综图| √禁漫天堂资源中文www| 日韩欧美一区视频在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 十八禁网站网址无遮挡| 在线 av 中文字幕| 成年美女黄网站色视频大全免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 美女主播在线视频| 老熟女久久久| 搡老乐熟女国产| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 久9热在线精品视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美另类一区| 青春草视频在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 午夜久久久在线观看| 1024香蕉在线观看| 久久精品国产综合久久久| 天堂中文最新版在线下载| 丝袜在线中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区日韩欧美中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品一区二区在线观看99| 99久久综合免费| 日韩大码丰满熟妇| 日韩一区二区三区影片| 女人精品久久久久毛片| 国产精品久久久av美女十八| 午夜免费鲁丝| www.999成人在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 老鸭窝网址在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久ye,这里只有精品| 成年人免费黄色播放视频| 97人妻天天添夜夜摸| 18在线观看网站| 男女午夜视频在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 宅男免费午夜| 99国产精品一区二区三区| 一级片免费观看大全| 国产深夜福利视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品.久久久| 精品国产国语对白av| 国产精品成人在线| 亚洲图色成人| 亚洲五月婷婷丁香| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲专区中文字幕在线| 日本vs欧美在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 国产麻豆69| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 大片电影免费在线观看免费| 午夜免费成人在线视频| 大码成人一级视频| av欧美777| 欧美国产精品一级二级三级| 91精品三级在线观看| 日韩大片免费观看网站| 免费看av在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 9热在线视频观看99| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产成人精品无人区| 色播在线永久视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产高清国产精品国产三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 韩国精品一区二区三区|