腐植酸鈉對(duì)酵母菌發(fā)酵特征的影響

■史俊祥齊景偉安曉萍劉　娜羅旭光陳大勇

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011517；3.內(nèi)蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010011 )

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腐植酸鈉對(duì)酵母菌發(fā)酵特征的影響

■史俊祥1齊景偉1安曉萍1劉娜2羅旭光1陳大勇3

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011517；3.內(nèi)蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010011 )

摘要：試驗(yàn)通過(guò)在種子液培養(yǎng)基中添加腐植酸鈉，探討腐植酸鈉對(duì)酵母菌發(fā)酵特性的影響。將腐植酸鈉按不同比例添加到酵母菌種子液培養(yǎng)基中，以活菌數(shù)為指標(biāo)篩選腐植酸鈉的最適添加量；再將含有最適比例腐植酸鈉的酵母菌種子液接種到稻殼粉、精料、豆粕和統(tǒng)糠4種固態(tài)培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)，可溶性糖、可溶性蛋白和真蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果為：種子液中添加1%~ 4%的腐植酸鈉對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，當(dāng)腐植酸鈉添加量為2%時(shí)，酵母菌活菌數(shù)最高（P< 0.05）。種子液中添加腐植酸鈉可明顯改善酵母菌在固態(tài)培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性:種子液中添加腐植酸鈉可顯著提高4種固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中酵母菌的活菌數(shù)，且在豆粕中提高量最大（P<0.05）；可顯著降低精料、豆粕、統(tǒng)糠發(fā)酵物中的可溶性糖含量，提高稻殼粉中可溶性糖的含量，其中統(tǒng)糠中可溶性糖含量降低最為明顯（P<0.05）；可顯著提高精料發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白質(zhì)含量（P<0.05），對(duì)稻殼粉、豆粕和統(tǒng)糠三種培養(yǎng)基中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響不顯著（P>0.05）；可顯著增加稻殼粉、精料、豆粕和統(tǒng)糠4種培養(yǎng)基中真蛋白質(zhì)含量（P<0.05），其增加率由高到低依次為：稻殼粉、精料、統(tǒng)糠、豆粕。結(jié)果顯示，種子液中添加腐植酸鈉可顯著影響酵母菌固態(tài)發(fā)酵的特征，進(jìn)而提高發(fā)酵效果，改善發(fā)酵飼料品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：腐植酸鈉；酵母菌；發(fā)酵特征

植酸鈉是腐植酸的鈉鹽，是褐煤、草煤、風(fēng)化煤等用硝酸、氫氧化鈉處理，通過(guò)氧化、堿提取、酸凈化等工藝制得的一類腐植酸類物質(zhì)[1]。腐植酸鈉色澤烏黑發(fā)亮，是富有閃爍光澤的無(wú)定型顆粒，無(wú)毒、無(wú)臭、無(wú)腐蝕，極易溶于水，水溶液呈醬油色膠體溶液，具有較強(qiáng)的吸附力和絡(luò)合力[2]。在畜牧獸醫(yī)方面，腐植酸鈉具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗病力、提高生產(chǎn)性能、解毒等功效[3-4]。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注腐植酸鈉及其類似物質(zhì)與微生物的關(guān)系。研究表明，腐植酸鈉能夠被微生物吸附，具有促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)代謝、抑制有害菌生長(zhǎng)的作用[5-8]。但是，國(guó)內(nèi)外研究方向大多數(shù)從單一液體發(fā)酵液或單一固體發(fā)酵基質(zhì)方面研究，關(guān)于研究在種子液中添加腐植酸鈉對(duì)酵母菌固態(tài)發(fā)酵特征的影響鮮有報(bào)道。故本試驗(yàn)以酵母菌為菌種，探討在酵母菌種子液中添加腐植酸鈉對(duì)固態(tài)培養(yǎng)基中活菌數(shù)、可溶性糖、可溶性蛋白和真蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)的影響，為腐植酸鈉在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

酵母菌（Yeast）為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2原料

精料、稻殼粉、棉粕、統(tǒng)糠、豆粕和麩皮均購(gòu)于內(nèi)蒙古優(yōu)牧特農(nóng)牧科技股份有限公司，腐植酸鈉購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.3培養(yǎng)基

培養(yǎng)酵母菌所用培養(yǎng)基為麥芽汁液體培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為精料培養(yǎng)基、豆粕培養(yǎng)基（豆粕與麩皮4∶1的比例構(gòu)成）、稻殼粉培養(yǎng)基（稻殼粉與棉粕4∶1的比例構(gòu)成）、統(tǒng)糠培養(yǎng)基（統(tǒng)糠與棉粕4∶1的比例構(gòu)成），料水比1∶1；活菌計(jì)數(shù)時(shí)所用培養(yǎng)基為麥芽汁固體培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4儀器設(shè)備

離心機(jī)、超凈臺(tái)、滅菌鍋、分光光度計(jì)、電爐、水浴鍋、20 ml刻度試管、刻度吸管、記號(hào)筆、吸水紙適量、500 ml容量瓶、10 ml離心管、50 ml離心管等。

1.1.5試劑

麥芽汁液體培養(yǎng)基、90%苯酚溶液、9%苯酚溶液、80%乙醇、濃硫酸（比重1.84）、蔗糖、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸試劑、磷酸氫二銨、磷酸、酒石酸。

1.2方法

1.2.1種子液的制備

將保存的菌種按5%接入到滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1研究腐植酸鈉對(duì)種子液中酵母菌活菌數(shù)的影響

將腐植酸鈉按0%、0.5%、1%、2%、4%和8%（v/v）的比例添加麥芽汁液體培養(yǎng)基中，121℃下滅菌15 min，冷卻至35℃左右接種5%已活化的酵母菌菌種，37℃下培養(yǎng)24 h備用。測(cè)定活菌數(shù)，確定種子液中腐植酸鈉的最適添加量。

1.2.2.2種子液添加腐植酸鈉對(duì)酵母菌固態(tài)發(fā)酵特征的影響

根據(jù)1.2.2.1試驗(yàn)結(jié)果，將含最適添加量腐植酸鈉的種子液按10%比例接種到已高溫、高壓滅菌的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃下發(fā)酵48 h備用。測(cè)定其發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)、可溶性糖、可溶性蛋白、真蛋白的含量。

1.2.3活菌數(shù)測(cè)定

活菌數(shù)的測(cè)定采用平板稀釋涂布計(jì)數(shù)法[9]。

1.2.4可溶性糖含量測(cè)定

可溶性糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]。

1.2.5可溶性蛋白的測(cè)定

可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[11]。

1.2.6真蛋白的測(cè)定

真蛋白的測(cè)定采用改良福林酚法[12]。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.2進(jìn)行單因子方差分析（ANOVA）,用Duncan's法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；其它數(shù)據(jù)均采用Excel 2007進(jìn)行處理。

2　結(jié)果

2.1腐植酸鈉對(duì)種子液中酵母菌活菌數(shù)的影響

不同腐植酸鈉添加量對(duì)種子液中酵母菌活菌數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1腐植酸鈉對(duì)種子液中酵母菌活菌數(shù)的影響

由表1可知，隨著腐植酸鈉添加量的增加，種子液中活菌數(shù)大致呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律，在種子液中添加1%~4%的腐植酸鈉對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。在一定范圍內(nèi)，腐植酸鈉添加量越多，酵母菌的活菌數(shù)越多。對(duì)照組活菌數(shù)9.50×108cfu/ml，1%、2%、4%腐植酸鈉組的活菌數(shù)為13.20×108、20.47× 108、14.63×108cfu/ml，與對(duì)照組相比顯著增多（P< 0.05），說(shuō)明在種子液中添加1%~4%的腐植酸鈉對(duì)酵母菌有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。且腐植酸鈉添加量為2%時(shí)，酵母菌活菌數(shù)最高，因此，腐植酸鈉在酵母菌種子液中的最佳添加量為2%。

2.2種子液中添加腐植酸鈉對(duì)不同固態(tài)培養(yǎng)基中酵母菌活菌數(shù)的影響

以接種腐植酸鈉添加量為2%的種子液的樣品為試驗(yàn)組，接種未加腐植酸鈉的種子液的樣品為對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2種子液添加腐植酸鈉對(duì)不同固態(tài)培養(yǎng)基酵母菌活菌數(shù)的影響(×107cfu/g)

由表2可知，試驗(yàn)組活菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且稻殼粉、精料、豆粕和統(tǒng)糠四種培養(yǎng)基中酵母菌的活菌數(shù)分別提高107.89%、40.91%、189.47%、54.17%，提高率由高到低依次為：豆粕、稻殼粉、統(tǒng)糠、精料。由此可見(jiàn)，種子液中添加腐植酸鈉可明顯促進(jìn)酵母菌在固態(tài)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，且在豆粕培養(yǎng)基中作用效果最大。

2.3種子液中添加腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中可溶性糖含量的影響

以接種腐植酸鈉添加量為2%的種子液的樣品為試驗(yàn)組，接種未加腐植酸鈉的種子液的樣品為對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行可溶性糖含量的測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3種子液中添加腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中酵母菌產(chǎn)可溶性糖含量的影響(%)

由表3可知，精料、豆粕、統(tǒng)糠試驗(yàn)組的可溶性糖含量均顯著低于對(duì)照組，且精料、豆粕、統(tǒng)糠培養(yǎng)基中可溶性糖含量分別降低38.52%、31.36%、52.99%，其降低率由高到低依次為：統(tǒng)糠、精料、豆粕。稻殼粉試驗(yàn)組的可溶性糖含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），提高率為120.00%。由此可見(jiàn)，種子液中添加腐植酸鈉可以明顯降低酵母菌發(fā)酵精料、豆粕、統(tǒng)糠中可溶性糖含量，提高酵母菌發(fā)酵稻殼粉中可溶性糖的含量。

2.4種子液中添加腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

以接種腐植酸鈉添加量為2%的種子液的樣品為試驗(yàn)組，接種未加腐植酸鈉的種子液的樣品為對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響(%)

由表4可知，精料試驗(yàn)組中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），提高率為10.05%。稻殼粉、豆粕和統(tǒng)糠試驗(yàn)組中可溶性蛋白含量與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。由此可見(jiàn)，種子液中添加腐植酸鈉可增加精料發(fā)酵物中的可溶性蛋白含量。

2.5種子液中添加腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中真蛋白質(zhì)含量的影響

以接種腐植酸鈉添加量為2%的種子液的樣品為試驗(yàn)組，接種未加腐植酸鈉的種子液的樣品為對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行真蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5腐植酸鈉對(duì)發(fā)酵底物中真蛋白質(zhì)含量的影響(%)

由表5可知，四種培養(yǎng)基試驗(yàn)組中真蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組，且稻殼粉、精料、豆粕和統(tǒng)糠四種培養(yǎng)基中真蛋白含量分別增加100.75%、77.23%、14.43%、34.39%，其增加率由高到低依次為：稻殼粉、精料、統(tǒng)糠、豆粕。由此可見(jiàn)，種子液中添加腐植酸鈉可增加發(fā)酵物中的真蛋白質(zhì)含量，且在稻殼粉培養(yǎng)基中的促進(jìn)作用最明顯。

3　討論

在種子液中添加適量腐植酸鈉可促進(jìn)酵母菌生長(zhǎng)，這與劉娜等[5]研究腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)生促進(jìn)作用的結(jié)果相一致。Tikhonov等[7]發(fā)現(xiàn)，濃度為0.1 g/l的腐植酸能對(duì)來(lái)自土壤和腸道的66株細(xì)菌產(chǎn)生促進(jìn)作用的結(jié)果相似，可能是由于腐植酸鈉的吸附作用，使更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸附在腐植酸鈉上供微生物利用；同時(shí)，腐植酸鈉作為優(yōu)質(zhì)碳源直接參與了微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而使種子液中活菌數(shù)增加。娜仁高娃等[6]研究腐植酸鈉對(duì)大腸桿菌抑菌作用時(shí)發(fā)現(xiàn)腐植酸鈉可以改變其細(xì)胞膜通透性。在本試驗(yàn)中，可能是腐植酸鈉改變了酵母菌的細(xì)胞膜的通透性，使大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于通過(guò)細(xì)胞膜，參與其代謝，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。腐植酸鈉增強(qiáng)了酵母菌對(duì)碳源、氮源的利用能力，進(jìn)而提高了其代謝能力。但是這種代謝能力的改變隨著培養(yǎng)基的不同而不同。精料、豆粕、統(tǒng)糠的試驗(yàn)組中可溶性糖消耗量高于對(duì)照組，對(duì)于這三種發(fā)酵基質(zhì)來(lái)說(shuō)，酵母菌主要是利用原料中的可溶性糖作為營(yíng)養(yǎng)源，合成酵母菌自身細(xì)胞蛋白質(zhì)[13]。由于稻殼粉含有大量的纖維素[14]，酵母菌發(fā)酵主要利用纖維素，將其分解產(chǎn)生小分子單糖，致使培養(yǎng)基中可溶性糖含量提高?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是指在瘤胃pH值的緩沖液中可以溶解的那部分蛋白質(zhì)[15]，精料是一種復(fù)合物，其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于多種物質(zhì)，酵母菌在腐植酸鈉的作用下，使精料中多種物質(zhì)的發(fā)酵能力提高，進(jìn)而提高了發(fā)酵物中的可溶性蛋白質(zhì)；而其他三種發(fā)酵基質(zhì)屬于單一物質(zhì)，雖可溶性蛋白質(zhì)有所增加，但與對(duì)照組相比，差異并不顯著。由于腐植酸鈉的作用，酵母菌生長(zhǎng)代謝能力增強(qiáng)，繁殖加快，產(chǎn)生了大量的菌體蛋白，使發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量顯著增加。

4　結(jié)論

本文討論了在種子液中添加腐植酸鈉對(duì)酵母菌固態(tài)發(fā)酵特征的影響，在種子液中添加適量的腐植酸鈉，研究含腐植酸鈉的種子液對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)、可溶性糖、真蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)含量的影響，得到結(jié)論如下：

①在種子液中添加1%~4%的腐植酸鈉可明顯促進(jìn)生長(zhǎng)。且腐植酸鈉添加量為2%時(shí)，酵母菌活菌數(shù)最高。

②種子液中添加腐植酸鈉可明顯促進(jìn)酵母菌在固態(tài)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，4種培養(yǎng)基試驗(yàn)組活菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組，分別提高107.89%、40.91%、189.47%、54.17%，其中豆粕培養(yǎng)基中酵母菌活菌數(shù)提高最多。

③種子液中添加腐植酸鈉可明顯降低精料、豆粕、統(tǒng)糠發(fā)酵物中的可溶性糖含量，降低率分別為38.52%、31.36%、52.99%，在統(tǒng)糠培養(yǎng)基中的降低最多；稻殼粉試驗(yàn)組中可溶性糖含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提高率為120.00%。

④種子液中添加腐植酸鈉可顯著提高精料發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白質(zhì)含量，提高率為10.05%。對(duì)稻殼粉、豆粕和統(tǒng)糠三種培養(yǎng)基中可溶性蛋白含量的影響不顯著。

⑤種子液中添加腐植酸鈉可顯著增加發(fā)酵物中的真蛋白質(zhì)含量，稻殼粉、精料、豆粕和統(tǒng)糠四種培養(yǎng)基中真蛋白質(zhì)含量分別增加100.75%、77.23%、14.43%、34.39%，其增加率由高到低依次為：稻殼粉、精料、統(tǒng)糠、豆粕。

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

The influence of sodium humate on fermentation characteristics of yeast

Shi Junxiang, Qi Jingwei, An Xiaoping, Liu Na, Luo Xuguang, Chen Dayong

Abstract：This experiment was conducted to study the influence of sodium humate(HS) on fermenta?tion characteristics of yeast by adding the sodium humate in the medium for growing liquid seeds. Screen optimum addition amount of sodium humate by the number of living cells in the liquid seeds medium adding different proportions of sodium sumate; the number of living bacterium, soluble sugar, soluble protein and protein in the rice husk powder, grain feed, soybean meal and bran inoculated yeast seed liquid with the optimum amount of sodium humate was determined. The result show that①1%~4% of sodium humate promoted the growth of yeast in the seed liquid and the highest number of living bacterium of yeast in 2% group(P<0.05). Sodium humate in the liquid seeds medium can obvi?ously improve fermentation characteristics of yeast in the solid state medium: sodium humate increased number of living bacterium and in soybean meal significantly (P<0.05);②HS significantly reduced the amount of soluble sugar of the grain feed, soybean meal, bran and increased the amount of soluble sugar in rice husk powder (P<0.05); HS signifi?cantly improved the soluble protein content in the concentrate (P<0.05), and there was no signif?icant effect in the rice hull powder, soybean meal, bran(P>0.05). Sodium humate increased the number of living bacterium and the greatest increase in soybean meal significantly (P<0.05); Sodium humate significantly increased amount ofbook=45,ebook=48true protein in four solid culture medium (P<0.05) and its increasing rate from high to low in four for: rice husk powder, concentrate, bran and soybean meal. The results showed that the seed liquid adding sodium humate could significantly affect the fermentation characteristics of yeast and improve the ef?fect of fermentation and the quality of fermented feed.

Key words：sodium humate；yeast；fermentation characteristics

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技計(jì)劃課題[2013BAD10B02-04]；內(nèi)蒙古科技創(chuàng)新引導(dǎo)資金[20140608]；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化[CGZH20130009]

收稿日期：2015-12-15

通訊作者：齊景偉，教授，碩士生導(dǎo)師。

作者簡(jiǎn)介：史俊祥，碩士，研究方向?yàn)樯镲暳稀?/p>

中圖分類號(hào)：S816.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）04-0044-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.011