熒光免疫層析法降鈣素原檢測試劑盒臨床性能評估

郭莉娜，楊啟文，伊 潔，謝秀麗，王 瑤，王 賀，徐英春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京100730

熒光免疫層析法降鈣素原檢測試劑盒臨床性能評估

郭莉娜，楊啟文，伊 潔，謝秀麗，王 瑤，王 賀，徐英春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京100730

目的 評估熒光免疫層析法試劑盒檢測降鈣素原的性能。方法 參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP5-A和EP6-A文件方法，對熒光免疫層析法試劑盒 (TEBSUN)檢測降鈣素原的精密度、線性、方法學(xué)比對、相對靈敏度和特異性進(jìn)行評估。結(jié)果 熒光免疫層析法試劑盒檢測降鈣素原精密度較好，低濃度和高濃度樣本精密度的變異系數(shù)分別為8.3%和4.7%;線性驗證試驗結(jié)果顯示，在試劑盒標(biāo)示的檢測范圍內(nèi)具有良好的線性梯度關(guān)系 (r=0.9989);方法學(xué)比對結(jié)果顯示，熒光免疫層析法試劑盒與梅里埃VIDAS酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)的降鈣素原試劑盒檢測結(jié)果一致性良好 (r=0.9770);在0.5和2.0 ng/ml兩個濃度水平，熒光免疫層析法試劑盒相對于酶聯(lián)免疫熒光法試劑盒的靈敏度和特異性均大于86%，與其測定結(jié)果的總體符合率為93.75%。結(jié)論 熒光免疫層析法試劑盒檢測降鈣素原的精密度、線性、方法學(xué)比對、相對靈敏度和相對特異性等性能評價較好，適用于臨床標(biāo)本檢測。

降鈣素原;熒光免疫層析法;酶聯(lián)免疫熒光法;性能評估

Med J PUMCH，2016，7(3):208－211

降鈣素原 (procalcitonin，PCT)是降鈣素的前體，是由116個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為127 000的糖蛋白。在正常生理情況下，由甲狀腺C細(xì)胞分泌產(chǎn)生，健康人血液中PCT濃度非常低，小于0.05 ng/ml［1］。在膿毒血癥、系統(tǒng)性感染及促炎癥反應(yīng)刺激下，機(jī)體多個組織、多種細(xì)胞均可產(chǎn)生PCT并釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，血清 PCT值將成百上千倍于正常水平［2］。PCT在感染發(fā)生后的最初3 h即可測得，6～12 h達(dá)到峰值，其半衰期長，血PCT水平與感染及損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，已被推薦作為細(xì)菌感染膿毒癥的診斷、療效檢測及預(yù)后評估的有效指標(biāo)［3］。本研究以梅里埃VIDAS酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)檢測結(jié)果為參照，對熒光免疫層析法試劑盒檢測PCT的性能進(jìn)行評估，以期了解該試劑盒能否滿足臨床需求。

材料和方法

標(biāo)本來源

收集2014年5月至8月北京協(xié)和醫(yī)院門診及住院患者中可疑細(xì)菌感染者無溶血、無脂血、無黃疸血清標(biāo)本共112份，其中男性64例，女性48例，患者平均年齡57.3歲;經(jīng)檢測血清PCT濃度覆蓋待評估試劑盒檢測線性區(qū)間0.01～100 ng/ml;按照VIDAS酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)的檢測結(jié)果，112例血清PCT濃度分布為:PCT≤0.25 ng/ml共21例，＞0.25～0.5 ng/ml共16例，＞0.5～2 ng/ml共30例，＞2～10 ng/ml共30例，＞10 ng/ml共 15例;其中重癥監(jiān)護(hù)室標(biāo)本占67.9%(76/112)。樣本來自臨床常規(guī)檢測剩余血清。

儀器與試劑

梅里埃VIDAS酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)及PCT檢測試劑盒(批號1002934040)，為梅里埃診斷產(chǎn)品 (上海)有限公司產(chǎn)品;天寶頌原生物熒光免疫分析儀(TEBSUN)及PCT檢測試劑盒 (批號01220140426)，為北京瑞禾宏業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

研究方法

檢測原理:酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)的檢測原理是結(jié)合一步免疫測定夾心法和最終熒光檢測法來檢測，固相管作為固相及移液裝置，檢測所需試劑預(yù)先配制好，分裝在密封的試劑條中待用。待檢樣本先與包被在固相上的抗PCT抗體結(jié)合，再與孔中堿性磷酸酶標(biāo)記的抗PCT單克隆抗體結(jié)合;以405 nm波長檢測底物水解后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度以反映PCT的濃度。檢測線性范圍為0.05～200 ng/ml。生物熒光免疫分析儀是利用熒光免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法原理進(jìn)行檢測。層析過程中，樣本中PCT與熒光標(biāo)記的PCT單克隆抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，在層析作用下沿著硝酸纖維素膜向前移動至檢測區(qū)域，被硝酸纖維素膜上包被的PCT單克隆抗體捕獲并形成復(fù)合物沉淀在T區(qū)。在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長的熒光信號，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號，通過信號轉(zhuǎn)化及設(shè)定的定標(biāo)曲線自動轉(zhuǎn)化為定量數(shù)據(jù)，計算出樣本中PCT的濃度。檢測線性范圍為0.01～100 ng/ml。

精密度評價:參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI) EP5-A程序［4］，以VIDAS試劑盒檢測結(jié)果為準(zhǔn)，選取高值和低值血清作為測試樣本，同一批測定中，用TEBSUN試劑盒分別重復(fù)測定高值和低值血清20次，評估試劑質(zhì)控品也要測試一次。試驗完成后收集數(shù)據(jù)應(yīng)先檢查有無離群點，離群點的判定標(biāo)準(zhǔn):計算20次數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，任何結(jié)果和均值的差值超過3倍標(biāo)準(zhǔn)差可認(rèn)為是離群點。追查離群點發(fā)生的原因，原因不明時，不能去除離群點。

方法學(xué)比對:112例血清標(biāo)本在同一時間分別應(yīng)用VIDAS試劑盒和TEBSUN試劑盒測定PCT值，按照配對樣本設(shè)計，使用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件行配對t檢驗，以判斷兩種試劑盒檢測結(jié)果的差異。

線性范圍驗證:參照CLSI EP6-A程序［5］，收集高值標(biāo)本 (H)和低值標(biāo)本 (L)。H為試劑盒說明書線性范圍上限血清標(biāo)本，無溶血、脂血及黃疸干擾; L為試劑盒說明書線性范圍下限的血清標(biāo)本，無溶血、脂血及黃疸干擾。將H和L按0∶10、1∶9、2∶8……9∶1、10∶0的比例各自配置混合，形成11個水平濃度的系列測試標(biāo)本。每個濃度樣本測試4次，所有樣本應(yīng)盡量在一次試驗中測試完成。記錄測定結(jié)果并計算均值。以測得的均值為實測值，與所計算的理論值進(jìn)行比較。用直線回歸分析對數(shù)據(jù)作處理，計算回歸方程Y=bX+a，b值 (斜率)應(yīng)在0.95～1.05之間。

相對靈敏度和特異性:以VIDAS試劑盒為參比試劑盒，分別以0.5和2.0 ng/ml為臨界值，計算TEBSUN試劑盒的各項特異性指標(biāo)。包括相對靈敏度、相對特異性、相對總體符合率。

質(zhì)量控制:質(zhì)控品 (批號:01220160316DC)隨每批次檢測樣本平行操作，當(dāng)質(zhì)控品結(jié)果超出規(guī)定范圍，不論試驗結(jié)果是否滿意都應(yīng)將數(shù)據(jù)棄之不用，重新進(jìn)行檢測。低濃度C1參考范圍:1.09～2.58 ng/ml;高濃度C2參考范圍:14.60～27.12 ng/ml。

結(jié)果

精密度

熒光免疫層析法檢測試劑盒批內(nèi)精密度驗證試驗結(jié)果顯示，高值和低值標(biāo)本測定的變異系數(shù)分別為8.3%和4.7% (表1)，符合試劑盒性能要求，具有較好的精密性。

線性

熒光免疫層析法檢測試劑盒線性驗證試驗結(jié)果見表2。線性回歸方程為 Y=0.9989 X－0.207(r= 0.9989)，在試劑盒標(biāo)示的檢測范圍內(nèi)具有良好的線性梯度關(guān)系 (圖1)。

表1 熒光免疫層析法檢測試劑盒精密度試驗結(jié)果 (ng/ml)

表2 熒光免疫層析法檢測試劑盒線性驗證結(jié)果 (ng/ml)

圖1 熒光免疫層析法檢測試劑盒線性驗證分析結(jié)果

方法學(xué)比對

方法學(xué)比對試驗共檢測血清標(biāo)本112例，其中VIDAS試劑盒檢測結(jié)果中有5例＜0.05 ng/ml，為便于分析記為0.05 ng/ml;另有1例樣本檢測結(jié)果高于TEBSUN試劑盒檢測上限，予以去除。因此，將其中用2種試劑盒檢測均獲有效數(shù)據(jù)的111對數(shù)據(jù)行配對t檢驗，結(jié)果顯示兩種試劑盒測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=－0.550，P=0.583)。成對樣本相關(guān)系數(shù) r=0.9770 (P=0.000)，兩種試劑盒檢測結(jié)果呈顯著相關(guān)。

相對靈敏度和相對特異性

112例樣本的測定值以0.5 ng/ml為臨界值進(jìn)行定性統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示TEBSUN試劑盒相對于VIDAS試劑盒的檢測靈敏度為 97.30%，相對特異性為86.49%，與VIDAS試劑盒測定結(jié)果的相對總體符合率為93.75%(表3);以2.0 ng/ml為臨界值進(jìn)行定性統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示TEBSUN試劑盒測定的相對靈敏度為86.67%，相對特異性為98.50%，與VIDAS試劑盒測定結(jié)果的相對總體符合率為93.75%(表4)。

表3 以0.5 ng/ml為臨界值對試劑盒檢測結(jié)果的定性分析結(jié)果

表4 以2.0 ng/ml為臨界值對試劑盒檢測結(jié)果的定性分析結(jié)果

討論

隨著社會進(jìn)步，新型診療手段、治療方法及疫苗不斷出現(xiàn)，但感染性疾病仍然是威脅人類健康的重要因素［6］。由于感染性疾病臨床缺乏特異性，血常規(guī)、胸部影像學(xué)或微生物學(xué)檢查均無法快速鑒別致病菌。因此，如何早期診斷感染、評估感染程度并有效指導(dǎo)抗菌藥物的使用成為臨床診療所面臨的重要挑戰(zhàn)，特別對于危、急重癥感染，早期診斷并給予及時治療是提高生存率的關(guān)鍵。

PCT作為一個敏感性較高的生物學(xué)指標(biāo)，已成為與細(xì)菌性感染炎性反應(yīng)相關(guān)的特異性指標(biāo)，特別對于快速鑒別細(xì)菌性感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征 (systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及膿毒癥，尤其是重癥膿毒癥和感染性休克具有重要意義。

本研究表明熒光免疫層析法檢測試劑盒在線性范圍內(nèi)具有良好的精密度，在試劑盒標(biāo)示的檢測范圍內(nèi)具有良好的線性梯度關(guān)系;可滿足臨床檢測需要;方法學(xué)比對試驗顯示TEBSUN試劑盒與VIDAS試劑盒具有良好的相關(guān)性，兩種試劑盒測定值間線性偏倚無統(tǒng)計學(xué)意義;選擇0.5和2.0 ng/ml這兩個醫(yī)學(xué)決定水平是因為血PCT含量低于0.5 ng/ml通常認(rèn)為可排除膿毒血癥，介于0.5～2.0 ng/ml之間為可能膿毒血癥，高于2.0 ng/ml則為膿毒血癥或由細(xì)菌感染所致的SIRS［7］。在0.5和2.0 ng/ml這兩個水平，熒光免疫層析法檢測試劑盒的相對靈敏度和相對特異性均大于86%，與VIDAS試劑盒測定結(jié)果的相對總體符合率為93.75%。

研究中選擇法國梅里埃VIDAS酶聯(lián)免疫熒光法分析系統(tǒng)的PCT檢測試劑盒為參比試劑，該試劑是目前本院及國內(nèi)多家醫(yī)院檢驗科常規(guī)采用的PCT檢測試劑盒，檢測性能良好。以該試劑盒為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對國產(chǎn)熒光免疫層析法分析試劑盒性能評估發(fā)現(xiàn):該產(chǎn)品檢測PCT靈敏度和特異性較高，不需要昂貴的大型設(shè)備，利于床旁檢測，既節(jié)約了醫(yī)療成本，同時也實現(xiàn)了更快速 (檢測時間8 min)報告，為臨床感染診療提供較為快速準(zhǔn)確的檢驗結(jié)果。

本研究在選取標(biāo)本時排除了溶血、脂血、黃疸血清，故用熒光免疫層析法檢測試劑盒檢測PCT時，對于上述干擾因素的屏蔽能力還有待進(jìn)一步研究探討。

綜上，熒光免疫層析法試劑盒檢測PCT無需昂貴的設(shè)備，操作簡單，耗時短，與酶聯(lián)免疫熒光法試劑盒測定結(jié)果總體符合率較高，分析性能基本可滿足臨床檢測要求。

［1］Lee H．Procalcitonin as a biomarker of infectious diseases［J］．Korean J Intern Med，2013，28:285-291．

［2］Becker KL，Snider R，Nylon ES．Procalcitonin in sepsis and systemic inflammation:a harmful biomarker and a therapeutic target［J］．Br J Pharmacol，2010，159:253-264．

［3］降鈣素原急診臨床應(yīng)用專家共識組．降鈣素原 (PCT)急診臨床應(yīng)用的專家共識［J］．中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2012，21:944-951．

［4］CLSI．EP5-A．Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices［S］．Wayne，PA:CLSI，1999．

［5］CLSI．EP6-A．Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach［S］.Wayne，PA: CLSI，2003．

［6］Morens DM，F(xiàn)auci AS．Emerging Infectious Diseases:Threats to Human Health and Global Stability［J］．PLoS Pathog，2013，9:e1003467．

［7］Schneider HG，Lam QT．Procalcitonin for the clinical laboratory:a review［J］．Pathology，2007，39:383-390．

Performance Evaluation of Fluorescence Immunochromatography Kit in Detection of Procalcitonin

GUO Li-na，YANG Qi-wen，YI Jie，XIE Xiu-li，WANG Yao，WANG He，XU Ying-chun

Department of Clinical Laboratory，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

XU Ying-chun Tel:010-69159766，E-mail:xycpumch@139．com

Objective To evaluate the performance of fluorescence immunochromatography kit in detecting procalcitonin．Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)EP5-A and EP6-A，the performance of fluorescence immunochromatography kit(TEBSUN)in detecting procalcitonin was evaluated in the aspects of precision，linearity，methodology comparison，relative sensitivity，and relative specificity．Results The fluorescence immunochromatography kit showed high precision，the coefficients of variation (CV)of low and high concentration samples were 8.3%and 4.7%，respectively．Result of liner verification test showed good linear correlation within the indicated test range(r=0.9989)．In methodology comparison tests，the fluorescence immunochromatography kit had good consistency with VIDAS enzyme-linked immunofluorescence kit(r=0.9770)．The relative sensitivity and specificity of the fluorescence immunochromatography kit compared with the enzyme-linked immunofluorescence kit were both higher than 86%at 0.5 ng/ml and 2.0 ng/ml level．The total consistency of the two diagnostic kits was 93.75%．Conclusion The fluorescence immunochromatography kit has good performance in precision，linearity，methodology comparison，relative sensitivity，and relative specificity，suggesting that it meets the requirements of clinical tests．

procalcitonin;fluorescence immunochromatography;enzyme-linked immunofluorescence;performance evaluation

徐英春 電話:010-69159766，E-mail:xycpumch@139．com

R446.11

A

1674-9081(2016)03-0208-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2016.03.010

2015-02-02)