一株H1N1亞型豬流感病毒的分離與鑒定及部分生物學(xué)特性的研究

黃燕玲

（廣西南寧雷克斯商貿(mào)有限公司，廣西南寧 530001）

一株H1N1亞型豬流感病毒的分離與鑒定及部分生物學(xué)特性的研究

黃燕玲

（廣西南寧雷克斯商貿(mào)有限公司，廣西南寧 530001）

本研究從廣西某規(guī)?；i場(chǎng)臨床病豬肺臟組織中分離到一株豬流感病毒，并對(duì)該毒株進(jìn)行了亞型鑒定和部分生物學(xué)特性的研究。結(jié)果顯示分離到的豬流感病毒為H1N1亞型，HA效價(jià)最高達(dá)到27。對(duì)該毒株分別進(jìn)行耐熱性實(shí)驗(yàn)、耐酸性實(shí)驗(yàn)、乙醚和氯仿敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該毒株對(duì)熱不穩(wěn)定，并對(duì)酸、乙醚和氯仿均敏感，說明該毒株對(duì)自然的抵抗力較差。

豬流感病毒；分離鑒定；生物學(xué)特性

豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）屬于正粘病毒科，可引起豬的急性傳染性群發(fā)性的豬呼吸道疾病-豬流感（swine influenza，SI）。豬流感病毒的首次記載可以追溯到1918年在人群中廣泛流行的西班牙大流感，在西班牙流感流行期間，美國(guó)中北部豬群中也出現(xiàn)類似于人流感的流感樣癥狀，并且有研究顯示為H1N1亞型流感病毒引起[1-3]，但當(dāng)時(shí)未分離到豬流感病毒。直到1931年，Shope分離到第一株豬流感病毒A/Swine/Iowa/15/31（H1N11）[4]。目前，豬流感在世界范圍內(nèi)呈廣泛性流行，遍及歐洲、美洲、亞洲、非洲等世界各地。在豬群中廣泛流行的亞型主要是H1N1、H1N2和H3N2，其中又包含基因來源不同的基因型：古典豬H1N1、類人H1N1、類禽H1N1、類人H3N2、基因重配H3N2和多基因型的H1N2[5，6]。豬流感一年四季均可發(fā)生，不同日齡、品種和性別的豬均可感染，豬群發(fā)病率達(dá)100%，死亡率低，無并發(fā)感染的病例能夠自然康復(fù)。豬流感是規(guī)?；i場(chǎng)普遍存在并且難以根除的疾病之一，其群發(fā)性發(fā)生的特點(diǎn)導(dǎo)致患病豬只的生產(chǎn)性能下降，直接影響了豬群的健康狀態(tài)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。更值得重視的是，豬流感在豬群中的發(fā)生，往往會(huì)引起其他繼發(fā)性感染，如巴氏桿菌病、豬呼吸與繁殖障礙綜合癥、胸膜肺炎放線桿菌病等等，這是由于豬流感病毒對(duì)呼吸道上皮具有高度特異性親和性而使呼吸道管壁上皮受到損傷而導(dǎo)致的繼發(fā)感染。由此，繼發(fā)感染或混合感染導(dǎo)致豬群死亡率增高，經(jīng)濟(jì)損失更是無法估量[7]。

2014年12月底，筆者從廣西某豬場(chǎng)的一例臨床病死保育豬的肺臟中分離到一株H1N1亞型的豬流感病毒，并對(duì)其部分理化特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2014年12月，廣西某豬場(chǎng)一例臨床病死保育豬肺臟。發(fā)病豬為保育豬（10～15kg），病死前表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽和流鼻涕等癥狀。

1.2 雞胚及試劑

9～11日齡SPF雞胚，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。M-MLV酶、Rnasin、dNTPs和Ex-Taq DNA Polymerase mix購(gòu)自Takara公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

豬流感病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄引物為Uni12：5'--AGC AAA AGC AGG--3'；豬流感病毒的鑒定檢測(cè)采用針對(duì)病毒M基因的RT-PCR檢測(cè)，引物序列參照文獻(xiàn)[8]；分離株的HA基因和NA基因進(jìn)行亞型鑒定采用RT-PCR的方法并參考文獻(xiàn)[9，10]的引物，引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒分離

將肺臟研磨后，用PBS溶液1：5稀釋混成勻漿，將勻漿吸入到EP管中，離心取上清，加入10 000IU的青、鏈霉素，放置4℃4h后，尿囊腔接種9～11日齡雞胚，0.2ml/胚，每份樣品接種4個(gè)胚，35℃孵育72h～96h，棄去接種后24h內(nèi)死亡雞胚，收獲尿囊液，對(duì)尿囊液測(cè)定HA效價(jià)和RT-PCR檢測(cè)。

1.5 分離株RT-PCR鑒定

1.5.1 RNA的提取 取本分離株尿囊液300 ?l，加入700?l Trizol Reagent RNA提取液，混勻，室溫放置10 min后，加入300 ?l的氯仿溶液，混勻后室溫靜置5 min，將該混合溶液12000 rpm 離心10 min，取600 ?l上層溶液放置到新的1.5 ml的EP管，加入等量的異丙醇，混合均勻后放置到-20℃ 冰箱沉淀 10 min，12000 rpm離心10 min，棄上清，加入75%的乙醇溶液后7500 rpm 離心5 min，棄掉乙醇溶液，倒置EP管放入50℃ 溫箱干燥，干燥后加入25 ?l 的DEPC水溶解RNA。

1.5.2 RT-PCR檢測(cè) 按照Takara公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒25?l逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×M-MLV buffer 5 ?l，dNTP（10mmol/ L）2 ?l，Uni12 1 ?l，M-MLV 0.5 ?l，Rnasin 0.5 ?l，16 ?l RNA，將反應(yīng)體系置于42℃ PCR儀中 60 min 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Takara 公司試劑盒的操作說明配制PCR反應(yīng)體系：Ex-Taq DNA Polymerase mix 12.5 ?l，上、下特異性引物（25?mol/L）各1 ?l，cDNA 2 ?l，加滅菌水補(bǔ)足25 ?l。檢測(cè)SIV的反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性3 min，95℃變性30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min；鑒定HA和NA亞型的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 ?l，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5.3 測(cè)序 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，按照上海生物工程有限公司膠回收試劑盒說明書進(jìn)行產(chǎn)物回收，將膠回收產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 分離株部分理化特性的研究

本研究采用探索性因子分析方法來驗(yàn)證結(jié)構(gòu)效度。首先需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行KMO樣本測(cè)量和Bartlett球體檢測(cè)來判斷問卷是否適合做因子分析。一般KMO值在0.8以上，Bartlett球形檢驗(yàn)的顯著水平(Sig.)<0.05表明可以做因子分析，本研究問卷的KMO 測(cè)量值>0.8，同時(shí)Bartlett球體檢測(cè)的顯著性概率<0.05，因此適合做因子分析。KMO和Bartlett的檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

1.6.1 耐熱性實(shí)驗(yàn) 取分離株雞胚尿囊液，分為5組，每組1 ml，分別置于 4℃作用60 min，50℃作用15、30和60 min及60℃作用10 min，每個(gè)處理的樣品分別接種3枚雞胚，35℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死雞胚液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.6.2 乙醚敏感試驗(yàn) 取分離株雞胚尿囊液1 ml，加入0.25ml乙醚，4℃作用24h，同時(shí)用滅菌生理鹽水代替乙醚作對(duì)照，每個(gè)處理樣品分別接種3枚雞胚，35℃培養(yǎng)，收集24～96h死亡或未死雞胚液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.6.3 氯仿敏感試驗(yàn) 取分離株雞胚尿囊液，分為2組，每組1 ml，一組加入終濃度為48 ml/L的氯仿，4 ℃作用10 min；另一組用滅菌生理鹽水代替氯仿作對(duì)照，每個(gè)處理樣品分別接種3枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)，收集24～96h死亡或未死雞胚液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.6.4 耐酸性試驗(yàn) 取含SIV雞胚尿囊液，等量分裝為2份，一份用0.1 mol/L鹽酸調(diào)至pH3.0，室溫下作用3 h，再用56g/L碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液將 pH值調(diào)至7.0；另一份加入滅菌生理鹽水，同樣室溫下放置1 h，尿囊液經(jīng)10倍稀釋后，每個(gè)處理樣品分別接種3枚雞胚，35℃培養(yǎng)，收集24～96 h死亡或未死雞胚液，測(cè)定HA效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和初步鑒定

將病豬肺臟的組織勻漿接種SPF雞胚盲傳三代，收集第三代的雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)，發(fā)現(xiàn)尿囊液對(duì)雞紅細(xì)胞懸液具有凝集現(xiàn)象，血凝價(jià)（HA）達(dá)到27。提取雞胚尿囊液RNA，應(yīng)用RTPCR檢測(cè)SIV為陽(yáng)性。進(jìn)行RT-PCR HA和NA亞型鑒定，擴(kuò)增出HA亞型的目的片段大小為442bp，NA亞型片段大小為668bp（圖1）并且其擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證實(shí)分離株的HA基因和NA基因分別為H1亞型和N1亞型，根據(jù)鑒定結(jié)果，該毒株為H1N1亞型豬流感病毒，對(duì)該毒株進(jìn)行命名為A/swine/Guangxi/1/2014。

圖1 豬流感分離株RT-PCR亞型鑒定的結(jié)果

2.2 分離株熱穩(wěn)定性測(cè)定、乙醚敏感試驗(yàn)、氯仿敏感試驗(yàn)及耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）進(jìn)行耐熱性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1，結(jié)果表明分離株為熱不穩(wěn)定型。將A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）新鮮尿囊液應(yīng)用乙醚、氯仿和酸處理后，接種雞胚，收集96h后的雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)，均無效價(jià)，說明分離株對(duì)乙醚、氯仿和酸敏感。

表1 A/swine/Guangxi/1/2014（H1N1）耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

目前，在世界范圍內(nèi)豬群中發(fā)現(xiàn)的SIV包括H1N1、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H9N2、H5N1、H3N8和H3N6等9種亞型，其中在豬群中主要的流行亞型為H1N1、H1N2和H3N2 3種[11]。單純性的豬流感并不會(huì)引起豬的死亡，因此其死亡率極低，但由于豬可作為禽流感病毒和人流感病毒基因重組的“混合器”，并且經(jīng)過基因重組后的新毒株可能具有感染人類的能力即其在“禽-豬-人”的流感病毒跨種屏障中具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，因此SI一直受到人們廣泛關(guān)注。自1997年至今，我國(guó)各地不斷地在進(jìn)行SI的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示各地豬群中均存在SIV的感染[12]。1999～2001年的SI血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)豬群中主要存在的是H1亞型和H3亞型SIV的感染；2002～2003年的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果則顯示了豬群中開始出現(xiàn)H9亞型和H5亞型SIV的感染，并在同一時(shí)間內(nèi)分離到了H9N2和H5N1亞型SIV[13]。

對(duì)于廣西地區(qū)而言，2005～2006年，梁家幸等對(duì)廣西地區(qū)2 156份豬血清進(jìn)行H1和H3亞型抗體進(jìn)行檢測(cè)，H1亞型抗體陽(yáng)性率為29.04%，H3亞型抗體陽(yáng)性率為31.54%[14]；高永銳等于2006年對(duì)廣西1 000份豬血清進(jìn)行了H3N2抗體的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其抗體平均陽(yáng)性率為25.7%[15]；2006～2007年間，黃勝斌等對(duì)2 500份血清進(jìn)行H1、H3、H5和H9亞型抗體進(jìn)行檢測(cè)，H1亞型平均抗體陽(yáng)性率為58.73%，H3亞型平均抗體陽(yáng)性率為49.13%，而H5和H9亞型均呈陰性[16]。至2004年至今，在GenBank上記錄的廣西SIV的分離株有95株，其中H1N1亞型有32株，H1N2亞型有29株，H3N2亞型有23株，H9N2亞型有8株和3株H5N1，這些數(shù)據(jù)對(duì)于我區(qū)乃至中國(guó)的豬流感防治和監(jiān)測(cè)具有重要的指導(dǎo)意義。

豬流感病毒的血凝特性易受到溫度的影響，本分離株對(duì)熱具有不穩(wěn)定性且對(duì)酸敏感，說明該毒株對(duì)自然的抵抗力較差，但對(duì)于其傳播能力、致病性、分離株的各個(gè)基因片段來源和遺傳進(jìn)化規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

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黃燕玲（1985—），女，廣西桂林人，大學(xué)學(xué)歷，從事臨床獸醫(yī)和養(yǎng)殖。