雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究進(jìn)展

韓玉婷，何 勇，許革學(xué)，朱艷平，馬秀園，王選年,*

(1.河南科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.新鄉(xiāng)學(xué)院 生物技術(shù)研究中心/生命科學(xué)與技術(shù)系，河南 新鄉(xiāng) 453003； 3.靈寶市畜牧局，河南 靈寶 472542)

雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究進(jìn)展

韓玉婷1，何 勇2，許革學(xué)3，朱艷平2，馬秀園1，王選年1,2*

(1.河南科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.新鄉(xiāng)學(xué)院 生物技術(shù)研究中心/生命科學(xué)與技術(shù)系，河南 新鄉(xiāng) 453003； 3.靈寶市畜牧局，河南 靈寶 472542)

傳染性法氏囊病病毒(IBDV)是雞傳染性法氏囊病(IBD)的病原。近年來IBDV變異毒株和超強(qiáng)毒株的流行，嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)疫苗已不能控制IBDV的流行，迫切需要研制新型疫苗。IBDV VP2蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此，利用VP2蛋白制備IBDV重組疫苗成為國內(nèi)外研究的熱點。綜述了IBDV VP2蛋白的作用及在不同表達(dá)系統(tǒng)中用VP2蛋白制備疫苗的研究進(jìn)展，以期為IBDV新型疫苗的開發(fā)提供參考。

雞； 傳染性法氏囊病病毒； VP2蛋白； 疫苗

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的危害雛雞的一種急性接觸性傳染病，主要感染雞法氏囊的B淋巴細(xì)胞，造成感染雞的免疫功能低下，從而引起免疫抑制。長期的免疫抑制可使雞群易感染其他疾病，機(jī)體對各種疫苗的免疫反應(yīng)下降，無法正常產(chǎn)生抗體，造成免疫失敗。目前IBDV毒株主要包括經(jīng)典毒株、經(jīng)典減毒株、突變株和超強(qiáng)毒株[1-2]。但由于IBDV具有易變異、毒力返強(qiáng)的特點[3]，傳統(tǒng)疫苗已不能阻斷IBDV的傳播[4-5]。同時，由于新毒株的不斷發(fā)現(xiàn)，給IBDV的防治帶來更大的挑戰(zhàn)。Hernández等[6]通過對南美洲的IBDV毒株進(jìn)行基因鑒定發(fā)現(xiàn)，南美洲毒株不同于已知的IBDV 的4種毒株，但該毒株是IBDV流行早期的1個典型毒株，目前已遍布全世界。Mohamed等[7]通過對印度分離的10個IBDV毒株進(jìn)行基因鑒定，發(fā)現(xiàn)7個毒株屬于IBDV 的超強(qiáng)毒株，其他3個毒株不同于歐洲流行株和亞洲流行株(包括日本和香港)，是印度獨有的毒株，這可能是導(dǎo)致疫苗免疫失敗的原因。因此，急需開發(fā)新的疫苗，用于預(yù)防IBDV新毒株的流行。由于VP2蛋白攜帶宿主保護(hù)性抗原決定簇，其可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并有血清型特異性，是IBDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白[8]。因此，研究利用VP2蛋白制備疫苗，對防控IBDV以及開發(fā)新型疫苗具有重要意義。

1 IBDV基因組結(jié)構(gòu)及VP2蛋白的作用

IBDV是一種無囊膜的RNA病毒，具有單層衣殼，呈二十面體立體對稱，T=13晶格分布，病毒粒子直徑約60 nm。由32個殼粒組成單層核衣殼，組成病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白主要以三聚體形式存在[8]。IBDV主要有2個基因片段組成，這2個基因段分別稱為A和B。A片段由3 036個堿基組成，編碼分子質(zhì)量約為110 ku的前體多聚蛋白NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH[9]，該多聚蛋白在翻譯后進(jìn)一步加工形成pVP2(aa 1—512)、VP4(aa 513—755)和VP3(aa 756—1012)[10]。pVP2在C末端有3個 alanine-alanine motifs [(T/A)XA↓A]結(jié)構(gòu)，構(gòu)成VP4裂解pVP2的作用位點，分別位于aa 487—488位、495—496位和501—502位。核衣殼形成過程中pVP2在感染細(xì)胞內(nèi)形成成熟VP2(aa 1—441)和4條短肽[11-12]。VP2、pVP2及其4條短肽共同參與IBDV核衣殼的組裝過程。成熟VP2的裂解位點位于aa 441—442，其裂解motif為439AGA↓F442，該motif與(T/A)XA↓A存在一定的同源性，表明VP4也參與了成熟VP2的形成。VP2構(gòu)成IBDV的外殼，由454個氨基酸組成，占IBDV蛋白質(zhì)總量的50%以上，是IBDV的主要抗原結(jié)構(gòu)[13]。A片段的小閱讀框架編碼VP5蛋白。B片段編碼所形成的VP1蛋白，由878個氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量大小約為90 ku[14]。

VP2和VP3是組成IBDV病毒核衣殼的主要成分。核衣殼外表面由260個VP2三聚體形成凸?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，約占病毒蛋白的51%，核衣殼的內(nèi)表面由200個Y型VP3三聚體結(jié)構(gòu)組成，約占病毒蛋白的40%[8]。VP2主要存在于核衣殼的外表面，攜帶病毒主要中和性抗原表位[15]，可誘導(dǎo)產(chǎn)生主要保護(hù)性中和抗體，是IBDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白。

2 IBDV VP2疫苗

2.1 IBDV VP2重組活載體疫苗

在基因工程活載體疫苗研究中，火雞皰疹病毒載體、禽痘病毒載體、馬立克病毒載體、禽腺病毒載體等基因工程重組活載體疫苗研究相對較多。Zanetti等[16]將2種IBDV毒株的VP2基因插入到火雞皰疹病毒中，構(gòu)建了2個重組病毒，1個不含外源啟動子，另1個含外源啟動子，將不同劑量的重組病毒同時免疫1周齡雛雞，進(jìn)行攻毒試驗，不含外源啟動子的重組病毒產(chǎn)生的中和抗體水平比較低，IBDV仍能感染雛雞，帶有外源啟動子的重組病毒免疫雛雞能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的中和抗體水平，保護(hù)雛雞不受IBDV的感染。將IBDVVP2基因插入到禽痘病毒中構(gòu)建重組病毒，并用重組蛋白注射1周齡雛雞，攻毒后發(fā)現(xiàn)，免疫雞可免于死亡，但法氏囊組織會有所損傷，不能起到完全的保護(hù)作用。將IBDVVP2基因克隆至SV40啟動子調(diào)控下的馬立克氏病毒(MDV)的US2位點，成功研制IBDV-MDV重組疫苗，能夠保護(hù)55%的雞群免受超強(qiáng)毒株攻擊，未出現(xiàn)法氏囊組織損傷[17]。目前IBDV重組活載體疫苗研究仍存在許多問題，導(dǎo)致疫苗免疫效果差，有很多方面原因，如啟動子的強(qiáng)弱，插入的外源基因?qū)Σ《据d體的影響，基因轉(zhuǎn)錄與否，重組蛋白能否被正確加工、修飾，重組疫苗的適用性等。因此，IBDV活載體疫苗的研制仍需要大力開展。

2.2 IBDV VP2核酸疫苗

核酸疫苗實質(zhì)是將外源基因插入到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，直接注射重組質(zhì)粒至動物體內(nèi)，外源基因在動物體內(nèi)表達(dá)，并刺激動物機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和性抗體。Jackwood等[18]成功構(gòu)建了IBDV的A片段表達(dá)質(zhì)粒并免疫雞群，雞群未出現(xiàn)法氏囊萎縮現(xiàn)象，阻止了IBDV的侵入。因此，IBDVVP2基因的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)雞群進(jìn)行免疫應(yīng)答，這為臨床上IBDV疫苗的研究明確了方向。核酸疫苗的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但受到毒株變異、表達(dá)量、疫苗的適用性等方面的制約，這一方向仍需要開展大量的研究工作。

3 IBDV VP2蛋白在不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)

IBDV VP2蛋白作為IBDV主要中和保護(hù)性抗原，國內(nèi)外獲得VP2重組蛋白的外源表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)、竹花葉病毒表達(dá)系統(tǒng)、雞痘病毒表達(dá)系統(tǒng)以及家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等。

由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)無法對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工、修飾，且VP2蛋白屬于三聚體，全基因表達(dá)時表達(dá)量很低。因此，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行VP2重組蛋白的表達(dá)需要改進(jìn)措施。例如，由于VP2高變區(qū)不在N端，去除N端親水區(qū)(約20～80個氨基酸)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)量，但全基因原核表達(dá)產(chǎn)量仍僅為7%～10%[19]。此外，使用BL21 PLUS(含稀有密碼子)宿主菌能提高蛋白質(zhì)表達(dá)量。由于BL21宿主菌無法進(jìn)行蛋白質(zhì)的加工、修飾，通過其表達(dá)獲得的VP2蛋白免疫原性差，并且獲得的VP2蛋白大部分是以包涵體形式存在。這些因素限制了在大腸桿菌中表達(dá)的IBDV VP2蛋白進(jìn)行廣泛使用。

為了獲得免疫原性好的IBDV VP2重組蛋白，Dieye等[20]將IBDV VP2片段成功轉(zhuǎn)入桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，將表達(dá)產(chǎn)物免疫雞群，能夠保護(hù)部分雛雞免受IBDV的侵入，但不能保護(hù)法氏囊組織免受損傷。林紅麗等[21]通過基因重組技術(shù)將IBDV致弱株的A片段重組于家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中并轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)家蠶產(chǎn)生免疫中和抗體。目前，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白制備的疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，存在一定的缺陷，限制了其在臨床生產(chǎn)中的應(yīng)用[22]。

目前，酵母表達(dá)系統(tǒng)是研究VP2蛋白利用較多的外源系統(tǒng)，Gao等[23]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)成功高效表達(dá)獲得了IBDV超強(qiáng)毒株的主要保護(hù)性抗原蛋白，研制的IBDV亞單位疫苗具有良好的安全性和免疫效力。Zhang等[24]應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白的表達(dá)量為0.459 mg/mL。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡以及動物試驗表明，表達(dá)的重組蛋白具有IBDV天然蛋白的生物活性和免疫原性。Macreadie等[25]用酵母表達(dá)IBDV大片段，獲得的重組蛋白免疫雞，刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的ELISA抗體和中和抗體，免疫雞血清可保護(hù)雛雞。Fahey等[26]用酵母表達(dá)的IBDV VP2蛋白免疫雞，不同時期均產(chǎn)生高的抗體水平。

以上結(jié)果表明，酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的IBDV VP2蛋白免疫效果比傳統(tǒng)疫苗好。同時，酵母表達(dá)系統(tǒng)簡單方便，成本低，表達(dá)產(chǎn)物易于純化，重組VP2蛋白可以正確折疊并進(jìn)行糖基化作用，具有天然蛋白所應(yīng)有的生物學(xué)活性。因此，用酵母表達(dá)生產(chǎn)的IBDV亞單位疫苗有很好的應(yīng)用前景。

4 展望

目前，預(yù)防IBDV最有效的方法是應(yīng)用傳統(tǒng)經(jīng)典毒株的弱毒疫苗和滅活疫苗免疫雛雞，但是由于環(huán)境中IBDV超強(qiáng)毒株及變異株的存在，IBDV對環(huán)境的抵抗力又比較強(qiáng)，傳統(tǒng)疫苗往往達(dá)不到有效預(yù)防IBDV的效果。用超強(qiáng)毒株的滅活油乳劑疫苗免疫產(chǎn)蛋種雞，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的母源抗體，保護(hù)雛雞在一定時間內(nèi)免受強(qiáng)毒感染，但是較高的母源抗體可以中和弱毒疫苗，造成雛雞弱毒疫苗的免疫失敗。因此，檢測雛雞的母源抗體水平，確定最佳首免時間，成為預(yù)防雞IBD發(fā)生的關(guān)鍵。同時，制備能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛的、高水平的IBDV抗體的疫苗也在IBDV預(yù)防中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于IBDV疫苗的研究集中在IBDV VP2蛋白上，期望通過不同的表達(dá)系統(tǒng)獲得免疫活性最好的蛋白質(zhì)用于疫苗的開發(fā)研究。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢，可以作為VP2蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行疫苗的開發(fā)。

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Research Progress on VP2 Protein and Vaccine of Infectious Bursal Disease Virus

HAN Yuting1,HE Yong2,XU Gexue3,ZHU Yanping2,MA Xiuyuan1,WAGN Xuannian1,2*

(1.College of Animal Sciences,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Life Science and Technology/Center for Biotechnology Research,Xinxiang University,Xinxiang 453003,China; 3.Lingbao City Bureau of Animal Industry,Lingbao 472542,China)

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a pathogen causing chicken infectious bursa disease (IBD).Due to the variation of IBDV strains and the prevalence of super virus in recent years,IBD become a serious disease that may threat to the development of the world chicken industry.The traditional vaccine is unable to resist the prevalence of IBD,and new IBD vaccine is urgently needed to control the spread of IBDV.As an important structural protein of IBDV,VP2 protein is used to prepare recombinant vaccine.It is an investigative hot spot for home and abroad experts.In this overview,the IBDV VP2 protein function and the research progress of using VP2 protein to prepare vaccine in different expression system were summarized,so as to provide reference for the development of new IBDV vaccines.

chicken; IBDV; VP2 protein; vaccine

2015-07-19

新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺項目(CP1311)

韓玉婷(1989-)，女，河南濮陽人，在讀碩士研究生，研究方向：分子免疫學(xué)與細(xì)胞病理學(xué)。 E-mail:97259058@qq.com

*通訊作者：王選年(1969-)，男，河南靈寶人，教授，博士，主要從事動物病理學(xué)與分子免疫學(xué)研究。 E-mail：wangxuannian@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)03-0020-04